【Application Note】高温下的超快多肽合成

Liberty PRIME™ 2.0 微波肽合成器是目前蕞先进的肽合成系统。它基于一锅法偶联脱保护的固相肽合成新方法，大大减少了循环时间和废液，达到前所未有的水平。该系统完成一个循环时间仅为 2 分钟 10 秒（适用于所有 20 种标准 Fmoc 氨基酸），仅产生 8mL 化学废物，是 CEM 高效 Liberty Blue 2.0 肽合合器的一半。Liberty PRIME 2.0 HT 24 是高通量合成标准多肽和复杂多肽的理想系统，能够在一天内自动合成多达 24 个肽。

介 绍

传统多肽固相合成包括重复地分别完成脱保护和偶联步骤，中间需要清洗。基于这样的假设，如果没有完全清洗和排除上一步的废液，将会产生错误的氨基酸插入。2013年我们的研究团队证实，省略偶联步骤后的清洗，不会影响多肽纯度 1。Liberty PRIME 使用了如图 1 2 所示的一锅偶联和脱保护的新工艺实现了省略偶联后清洗步骤。该技术涉及将脱保护试剂（碱）直接添加到偶联后混合物中。这基于以下原理，溶液中酯键更高的反应动力学能级，促使其快速水解或自缩合，从而避免树脂上氨基官能团的潜在副反应。然后在高温下不间断地进行 Fmoc 去除。试剂的优化使用使接近脱保护步骤结束时，反应混合物为中性。这种新程序具有几个优点：1.脱保护步骤的溶剂需求减少约 90%；2.脱保护后洗涤的溶剂需求减少 75%；3.更快的脱保护步骤，因为微波不需要时间缓慢下降；4.由于没有后偶联排放步骤，循环时间更短。

图1. Liberty PRIME 2.0 使用的一锅偶联/脱保护

使用一锅偶联/脱保护方法需要能够持续添加精确的小体积浓缩碱。为实现这一目标，Liberty PRIME 2.0 采用了专用泵送模块，能够在偶联步骤结束时以低至 0.25mL 的体积快速添加脱保护试剂。预先校准的泵模块不需要持续校准，从而避免了输送量的漂移。

此外， 主要清洗剂和激活剂 (Oxyma Pure) 也通过模块内类似的单独的泵输送，以提高仪器性能。

图2. PRIME 2.0上使用的集成泵模块

Liberty PRIME 2.0 还使用了 CarboMAX™ 偶联工艺，通过使用相对于氨基酸的更高比例的碳二亚胺（2倍当量）3，在高温下改进现有的碳二亚胺化学反应。这种偶联化学反应已被证明能使O-酰基异脲中间体更快形成，从而加快偶联速率，同时相应地减少差向异构化 4。Liberty PRIME 2.0 在 105℃ 下使用 CarboMAX 偶联工艺的高效 1 分钟偶联为所有 20 种标准 Fmoc 氨基酸（包括半胱氨酸和组氨酸）提供了出色的连接率和Z低的差向异构化率。

Liberty PRIME 自动微波肽合成仪完成了一系列众所周知的困难多肽合成，显示了其优秀的性能。注意：所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系统上合成。

材料和方法

试 剂

所有Fmoc氨基酸均购自CEM公司（Matthews ,NC）,并包含以下侧链保护基团：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Boc), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) and Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和Rink Amide ProTide^® LL 树脂也购自CEM公司。Rink Amide MBHA LL 和Fmoc-Gly-wang LL树脂购自MilliporeSigma 公司（Burlington, MA）。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酸(TFA)、3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三异丙基硅烷(TIS) 和乙酸购自Sigma-Aldrich (St. Louis, 莫）。二氯甲烷(DCM)、N,N 二甲基甲酰胺(DMF) 和无水乙酉迷(Et₂O) 购自VWR (West Chester, PA)。HPLC 级水(H₂O) 和HPLC 级乙腈(MeCN) 购自Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成

所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系统 (CEM Corp.) 上以 0.10mmol 规模合成，使用 CarboMAX 偶联和 一锅法偶联/脱保护法。在 DMF 中与 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma （5/10/5）在 105 °C 下偶联 60 秒。通过直接添加 0.5 mL 的 25% 吡咯烷/DMF到偶联后混合溶液中，开始脱保护步骤，并在排液前在 100 °C 下再继续反应 40 秒。随后进行一次 4 mL 洗涤。使用带有 TFA/ H₂O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系统在 40°C 下进行切割 30 分钟。切割后肽在冷乙酉迷中沉淀并冻干过夜。

多肽分析

在配备有 PDA 检测器的 Waters Acquity UPLC 系统上分析未经任何纯化的粗肽，该检测器配备 Acquity UPLC BEH C8 色谱柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系统连接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于结构测定。在 Waters MassLynx 软件上进行峰分析。使用 (i) H₂O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脱进行分离。

结 果

与 CEM 的 Liberty Blue 自动化微波肽合成仪上使用的标准方法相比，Liberty PRIME 上的一锅法偶联/脱保护工艺生产出高纯度肽，循环时间减少约 50%，化学废物总量减少 66% 。Liberty PRIME 上 0.10 mmol 规模的标准循环在脱保护和随后的偶联之间使用 4mL 的单次洗涤，仅产生 8mL 化学废物，总循环时间为 2 分 10 秒。表 1 显示了在 Liberty PRIME 上合成的一组八种肽的粗纯度、总合成时间和总化学废物的实验数据。

表1. Liberty PRIME上的多肽合

图3. UPLC-MS Analysis of crude 65-74ACP.

图4. UPLC-MS Analysis of crude ABC-20 mer.

图5. UPLC-MS Analysis of crude JR-10 mer.

图6. UPLC-MS Analysis of crude Exenatide.

图7. UPLC-MS Analysis of crude 7-37GLP1.

图8. UPLC-MS Analysis of crude PNIA(A10L).

图9. UPLC-MS Analysis of crude Parigidin-br-1.

然后研究了 Liberty PRIME 上使用的高温偶联方法潜在的差向异构化。特别是已知在偶联过程中对差向异构化敏感的半胱氨酸和组氨酸。差向异构化水平通过包括水解、随后衍生化和气相色谱分析（C.A.T. GmbH）等众所周知的标准方法进行研究。如表 2 所示，发现在室温下使用 HBTU/DIEA 活化方法观察到的差向异构化水平高于 90℃ 标准或 CarboMAX 偶联以及 Liberty PRIME 上 105℃ CarboMAX 偶联的差向异构化水平。使用 Fmoc-His(Boc)OH 代替 Fmoc-His(Trt)-OH 允许 90℃ 或 105℃ 的偶联温度，而差向异构化水平没有任何增加。这些结果进一步证明了标准的 HE-SPPS 或 CarboMAX 偶联方法特别适用于高温下的肽合成。

表2. CarboMAX 偶联方法的ABC-20mer 多肽中半胱氨酸和组氨酸的差向异构化水平

aFmoc-His(Trt)-OH; bFmoc-His(Boc)-OH; cFmoc-Cys(Trt)-OH.

结 论

Liberty PRIME 自动微波肽合成仪上使用的一锅偶联/脱保护方法能非常有效地合成各种肽。对所有 20 种氨基酸（包括半胱氨酸和组氨酸）使用了改进的 CarboMAX 偶联化学的标准循环，极大简化了序列优化需求。Liberty PRIME 2.0 的标准循环时间为 2 分钟，是标准肽和复杂肽高通量合成的理想选择，并且可以空前地减少废弃物产生。