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安捷伦科技（中国）有限公司时间：
2023-09-26行业：
仪器仪表 仪器仪表白酒风味、品质研究正成为行业热点。影响白酒品质的因素有多种，其中发酵是关键因素。大曲作为白酒酿造过程的发酵剂，不仅为白酒酿造提供微生物，还提供风味物质及其前体，因此，大曲的品质与白酒品质密切相关。羰基化合物是大曲的风味物质之一，其对大曲的品质影响很大。高覆盖分析大曲中的羰基化合物，不仅有助于评价大曲的品质，而且可以指导高品质白酒生产。但羰基化合物具有结构多样、质谱信号响应低等特点，需要高灵敏、高分辨质谱技术实现高覆盖检测。
为了满足行业前沿需求，中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究团队与茅台集团微生物研究团队合作，在 Journal of Chromatography A 发表题为“Profiling and annotation of carbonyl compounds in Baijiu Daqu by chlorine isotope labeling-assisted ultrahigh-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry”的研究论文，提出了一种基于氯同位素标记辅助结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-Q/TOF MS）高覆盖筛选和深度注释白酒大曲中羰基化合物的策略。采用该策略，在酱香型白酒大曲中检测和注释了 487 种羰基化合物，其中 341 个得到准确鉴定或推测鉴定。这是迄今为止大曲中羰基化合物数目最 多的报道。在准确鉴定的化合物中，有 5 种从未在白酒和大曲中报导过。
该研究建立的方法具有高效、经济、简便等优点，为复杂生物样品中羰基化合物的全景分析提供了一种新策略。
羰基化合物的整体注释策略
白酒大曲中羰基化合物的注释策略流程如下（图 1）：
首先，利用 Agilent 6546 Q-TOF 液质联用系统，对 2-肼基-4-氯吡啶（HP-Cl）标记后的样品全扫描分析，依据 Cl 元素的天然同位素特征及保留时间的一致性，提取出潜在羰基化合物。
其次，对潜在羰基化合物进行靶向 MS/MS 分析。
最 后基于化合物的 tR、MS1、MS/MS 和特征碎片，将提取出来的潜在羰基化合物注释为 6 个等级，用于对鉴定结果的综合判断。
图 1. 酱香型白酒大曲中羰基化合物的注释策略
本策略无需重同位素标记试剂，利用氯的天然同位素特征来筛选衍生化的羰基化合物，同时结合 MS1、预测保留时间（tR）、in silico MS/MS 和人工注释碎片等多维信息，实现复杂生物样本中羰基化合物的深度注释。
酱香白酒大曲中羰基化合物的高覆盖鉴定
采用上述方法，对酱香型白酒大曲中的羰基化合物进行了全面表征和鉴定。以 5- 羟甲基糠醛为例具体示意整个鉴定流程（图 2）。
图 2. 酱香型大曲中 5-羟甲基糠醛的鉴定过程：（A）大曲中 5-羟甲基糠醛的MS1同位素峰，（B）大曲中 5-羟甲基糠醛的 MS/MS（C）三个候选结构的tR，（D）tR = 4.58 min and m/z = 252.0539 待测峰的结构注释，（E）大曲和标样的 5-羟甲基糠醛 EIC 对比图，（F）大曲和标样的 5- 羟甲基糠醛 MS/MS 对比图
本研究在酱香型白酒大曲中共检出 487 种羰基化合物，其中 341 个得到准确鉴定或推测鉴定，对比已有文献，这是迄今为止大曲中羰基化合物数目最 多的报道。此外，在准确鉴定的化合物中，有 5 种羰基化合物从未在在白酒和大曲中报导过。
不同生态位和不同季节大曲的差异分析
文章进一步结合统计学分析，采用主成分分析（PCA）、火山图等，对不同生态位（黄、白、黑曲）和不同季节（春、夏、秋）生产的大曲羰基化合物进行了差异研究，发现：白、黄、黑曲中羰基化合物存在显著性差异（图 3）；夏、春、秋季大曲中的羰基化合物差异也很大（图 4）。这可能与制曲初期，黑色大曲的温度最 高，白色大曲的温度最 低，加上夏季温度高于春季温度和秋季温度，导致发酵温度影响羰基化合物在大曲中的分布，且发酵温度越高，产生的羰基化合物就越多的缘故。
图 3. 比较不同颜色夏季大曲中的羰基化合物：（A）PCA 得分图，（B）黑色大曲 vs 白色大曲的火山图，（C）黄色大曲 vs 白色大曲的火山图
图 4. 春、夏、秋黑大曲中羰基化合物的二维主成分分析得分图（A）、夏季大曲与春季大曲中羰基化合物的火山图（B）、夏季大曲与秋季大曲中羰基化合物的火山图（C）
为了研究造成不同大曲之间羰基化合物显著差异的原因，本研究还将羰基化合物与大曲的酸度、糖化能力、还原糖含量、水分和淀粉含量等理化参数进行了相关性分析（图 5）。夏季不同颜色大曲中的羰基化合物主要与大曲的酸度呈正相关，而与糖化力呈负相关。不同季节黑色大曲中的羰基化合物主要与大曲的酸度、还原糖含量和水分相关。且大曲的酸度、还原糖含量与大曲中的羰基化合物呈正相关，而大曲的水分与大曲中的羰基化合物呈负相关。可见，大曲的糖化力、酸度、还原糖含量和水分对大曲中的羰基化合物有很大的影响。因此，在大曲的制作过程中，调整这些参数将会影响大曲中的羰基化合物的产生，进而影响大曲的品质和白酒品质。
图 5. 理化指标与不同颜色大曲中羰基化合物变化的相关性研究（A）、大曲不同季节理化指标与羰基化合物变化的相关性研究（B）
本研究开发了一种基于氯同位素标记、超高效液相色谱-高分辨质谱联用（CIL-UHPLC-Q/TOF MS）技术，对白酒大曲中羰基化合物进行高覆盖率、高灵敏分析的策略，结合数据挖掘算法和统计分析，为揭示不同种类大曲羰基化合物代谢特征提供技术支撑，对大曲质量评估和白酒风味、品质研究具有重要意义。
专家介绍
许国旺
中国科学院大连化学物理研究所研究员
中国科学院大连化学物理研究所生物技术部常务副主任，中国科学院分离分析化学重 点实验室主任，代谢组学研究中心主任。2004 年获国家自然科学基金委杰出青年基金资助。现任中国化学会色谱专业委员会主任、中国抗 癌协会肿瘤代谢委员会副主任、中国生物工程学会系统生物医学专业委员会副主任、中国化学会理事等。
正在担任 TrAC-Trends Anal Chem 的特约编辑, Metabolites 的副主编及 Anal Chem（2021-2022）, Anal Chim Acta，J Proteome Res 等 10 多个杂志编委。国际 HPLC 会议科学委员会常委。
已在 PNAS, Nat Protoc, Nat Commun, Hepatology, Adv Sci, Diabetes Care, Cancer Res, Clin Chem, Anal Chem 等国际著名杂志发表多篇高水平文章。连续 4 次入选“全 球 100 名最 有影响分析科学家”，连续 7 年入选爱思唯尔“中国高被引学者”榜单。申请发明专利超百件（其中 90 多项已授权）。
课题组主要研究方向：复杂样品分离分析方法的创新性研究；代谢组学、暴露组学分析技术平台及其在疾病、中药、植物表型、食品安全等方面的应用研究。
参考文献：
https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.464110
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