植物表型组学研究技术 ——PlantScreen表型成像技术

植物表型组学研究技术

——PlantScreen表型成像技术

一、 什么是表型组？什么是表型组学？

自 20 世纪 90 年代初以来，生命科学领域出现了为引人注目的“组学”新概念和新学科，如基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）等。伴随各种组学的不断兴起和发展，90年代末，人们提出了表型组（phenome）和表型组学（phenomics）的概念（图1）。

很多科学家都试图为表型组和表型组学下一个为精确的定义。其中较为容易理解的表型组定义为：在细胞、组织、器官、生物体或种属水平上表现出的所有表型的组合。表型组学可定义为一门在基因组水平上系统研究某一生物或细胞在各种不同环境条件下所有表型的学科[2]。

由此，我们可以知道，和其他生物学中的组学类似，表型组学是与基因组学对应，研究基因组经过转录组、蛋白组、代谢组而ZZ表现出来的各种表型的变化（图2）。

图2. 基因型与表型的关系[3]

在之前很长时间的研究中，国际上尤其是中国的科学家只关注基因组学。但仅仅研究基因组学肯定是不够的。因为基因只有表达以后才能发挥其功能和作用。如果没有对一个基因组所对应的表型组进行研究，那么这个基因组的功能就只能说是一种推测、假说甚是臆测。因为没有经过精确的表型组实验，一个特定的基因组如何发挥作用是完全不清楚的，也不能知道这个基因组能够产生什么特殊的表型或者对不同环境条件有怎样的适应能力。这也是为什么从上世纪90年代末提出表型组和表型组学概念后，对它们的研究在国际上就逐渐变得炙手可热的原因（图3）。

因此，2013年Monya Baker在《Nature》发表文章“THE ‘OMES PUZZLE”将表型组学称为“前景光明（Aspiring）”的组学研究项目（图4）。

图4. 目前的各种组学项目，表型组(phenome)被认为是“前景极为光明的”[4]

二、 表型组学研究技术的发展

对于生物学家来说，表型从来都不是一个陌生的概念。从生物学尤其是植物学研究之初，科学家们就在不停地测量和描述植物的各种表型。但是从现代科学研究的角度来说，这种对于植物表型的研究一直处于较为简单和粗放的阶段。主要通过肉眼观察和简单测量获得一些对植物外部物理性状的描述，如株高、叶片数、开花数、分蘖数、叶面积、叶长等。多也就是通过简单公式进行一定的量化，如叶面积指数、植物紧实度等。同时，因为人力、资金、环境条件等原因，一般只能在植物生长期的几个阶段进行有限的几次测量，根本不能跟踪整个生活史的详细变化情况。

这种“经典”的主要局限于对植物外部物理性的描述、基本未涉及内部及生化的特征和性状的植物表型研究，对于现代表型组学研究是远远不够的（图5）。

现代植物表型组学研究希望在全基因组测序的基础上，对特定基因型海量表型参数进行高通量定量研究。而且这些表型参数并不单单是形态数据，还要包含了大量深层机理数据，使科学家能够进一步通过对表型和基因型的对照研究鉴定并预测可遗传的性状。

为达到这一目的，需要的研究技术有：

w 植物彩色成像分析技术——形态学表型数据

w 植物叶绿素荧光成像分析技术——光合系统运作机理表型数据

w 植物高光谱成像分析技术——色素组成、生化成分、氮素含量、水分含量等表型数据

w 植物热成像分析技术——表面温度分布、气孔导度与蒸腾等等表型数据

w 智能光照培养、浇灌与称重技术——提供植物生长的环境并研究不同环境条件对植物表型的影响

w 自动化传送和控制技术——综合控制各个部件，对培养植物进行传送，实现自动测量与整个生活史的连续培养

现代技术的发展已经为科学家达到这一目标提供了支持。但是现在的挑战是：1.如何将这些技术整合起来，建立用于不同植物物种的表型平台；2.缩小实验室与野外研究的差距[6]。

三、PlantScreen植物表型成像分析技术

PSI公司在2012年以FluorCam叶绿素荧光成像技术为核心，结合LED植物智能培养、自动化控制系统、植物热成像分析、植物近红外成像分析、植物高光谱分析、自动条码识别管理、RGB 真彩 3D 成像、自动称重与浇灌系统等多项先进植物表型技术，开发出了PlantScreen植物表型成像分析系统（图6）。

LED植物智能培养	自动化植物传送	RGB真彩3D成像	自动称重与浇灌系统
叶绿素荧光成像测量分析	植物热成像分析	植物近红外成像分析	植物高光谱分析

图6. PlantScreen植物表型成像分析系统及其各个功能模块

这一大型系统切合国际ZX的植物表型组学研究，以ZY化的方式实现了拟南芥、小麦、水稻、玉米乃各种其它植物的全方位生理生态与形态结构高通量自动成像分析。用于高通量植物表型成像分析测量、植物胁迫响应成像分析测量、植物生长分析测量、生态毒理学研究、性状识别及植物生理生态分析研究等。

1. PSI公司的技术优势

图7. 欧洲自动化花卉生产工厂

由于表型组学研究的兴起，现在有很多公司与科研机构都在开发用于表型组学研究的仪器系统。但如果仔细探究这些公司的发展过程，好像他们在成立之初就能开发这么全面、高端的仪器系统。实际上这得益于欧美成熟的植物自动化培养技术。这一技术在欧美广泛应用于花卉、蔬菜等的生产（图7）。这些公司大多是以植物自动化培养技术为基础，再从别的厂家采购一些光源、相机组装成所谓的表型研究仪器。这些厂家不但没有真正的植物表型科研背景；各个成像模块很多也是工业上使用的，并没有大量科学文献的支持，ZZ的数据精度根本无法满足真正表型研究的需要；甚很多数据结果都没有专用植物表型分析软件，而只有简单的图像获取功能。

而PSI公司则与这些厂家完全不同。

PSI公司是捷克科学院Nedbal教授与现任PSI公司总裁、布尔诺（孟德尔发现遗传定律的城市）植物表型研究中心主任Trtilek博士共同成立的，是真正DJ植物科学家建立的公司，本身就承接大量欧盟的科研项目并与捷克科学院联合成立了捷克变化中心（图8）。

图8. PSI公司总部及PSI植物表型研究中心，公司大门可见捷克变化中心和欧盟科研项目标志

2015年是“遗传学之父”孟德尔在捷克布尔诺发表其的豌豆杂交实验《植物杂交试验》论文150周年，PSI公司与欧洲工程技术中心（CEITEC）、捷克科学院CzechGlobe变化研究中心、Masarykova大学及孟德尔博物馆共同举办了“国际植物与藻类表型组学会议”（International Plant and Algal Phenomics Meeting IPAP 2015，图9），数十名欧美、亚洲的DJ植物科学家参加了本次会议。2016年9月还将举办IPAP 2016，详情请点击链接：IPAP2016。有兴趣参加本次会议的老师可与易科泰生态实验室联系：王慧娟 info@eco-lab.cn；李川 eco-lab@eco-tech.com.cn

图9. IPAP2015会议现场

图10. 应用于不同样品的各种FluorCam叶绿素荧光成像系统

PSI公司一直致力于开发各种植物表型相关研究技术，包括叶绿素荧光技术、植物光谱技术、LED智能培养技术及各种藻类研究技术等。其开发的FluorCam叶绿素荧光成像技术已成为世界上权威、使用广、种类全面、发表论文多的叶绿素荧光成像技术（图10）。无论是叶绿素荧光权威书籍《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也是本书的合作作者之一），还是引用次数高达1200的叶绿素荧光研究综述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都将FluorCam调制式叶绿素荧光成像技术的出现作为叶绿素荧光研究进入二维时代的里程碑[7, 8]。关于FluorCam叶绿素荧光成像技术的更多信息请查阅：如何选配适用的叶绿素荧光成像仪器。

图11. 德国尤里希研究中心（Forschungszentrum Jülich GmbH）使用PSI公司SL3500 LED光源开发的植物生长室[9]

而他们生产的各种LED光源被很多其他欧洲公司和科研机构直接用于集成生产各种植物生长箱和大型生长室（图11）。PlantScreen植物表型成像分析系统是将这些高精尖的科研仪器再辅以自动化控制部件集成的ZX仪器系统，并且制作了专用植物表型分析科学软件，每一个成像模块都可以在获得几十项表型相关参数和相应的成像图，保证了数据的精确性和可信度。PlantScreen是真正的科研级表型组学研究系统，受到国际科研机构和大型跨国种业公司的一致认可（图12）。

同时，PlantScreen植物表型成像分析系统由厂家专业工程师上门安装。系统配备专用的网络通讯软件，后续使用中可通过网络由厂家远程操作实现软件更新和实时故障诊断，对客户网络没有独立IP等特殊要求。这一通讯软件可以由用户自行决定开启和关闭并设置密码，不必担心数据通过网络外泄。

图12. 国内外装备PlantScreen的部分科研单位及跨国种业和农药公司

2. PlantScreen如何解决表型组学研究中的两个挑战

之前提到在表型组学研究中有两个挑战：1.如何将这些技术整合起来，建立用于不同植物物种的表型平台；2.缩小实验室与野外研究的差距。

对于DY个问题，PSI公司凭借自己的技术，根据客户具体需求，对每一套系统都进行了特别定制，从而实现了对拟南芥、小麦、水稻、玉米乃各种其它植物的精确表型组学研究（图13）。而一般的商用仪器，型号设计一旦定型就不能再做修改，往往不能适用于科学家的具体实验要求。

图13. 左：用于玉米、水稻、蔬菜的PlantScreen植物表型成像分析系统；右：捷克Palacký大学定制的用于拟南芥和豌豆的PlantScreen植物表型成像分析系统[10]

而缩小实验室与野外研究差距的方法，就是直接在野外大田中开展表型组学研究。为此，PSI公司开发了野外样带版的PlantScreen植物表型成像分析系统，ZD限度实现了野外的表型组学成像自动分析（图14）。同时，PSI正在开发可搭载到无人机上的小型表型成像分析平台。

图14. PlantScreen植物表型成像分析系统野外样带版

四、 PlantScreen植物表型成像分析技术应用案例

1. 叶绿素荧光成像分析

叶绿素荧光成像可以动态反映植物连续生长过程中光合系统光合能力的变化。图15中为盐胁迫处理的拟南芥。对照组与处理组的量子产额ΦPSII从处理后就开始产生差异，这反映了盐分对光系统II光下电子传递效率的影响。而从左侧的成像图中，我们可以通过颜色就直观地分辨出两者之间的差异。

图15. 盐胁迫下拟南芥的胁迫响应研究

这种连续高通量荧光监测，在一些快速胁迫表型分析中会更为有效。在给菜豆施加除草剂敌草隆后，我们可清晰地看到随着敌草隆被叶片吸收扩散，首先是主叶脉基部的光合系统受到损伤，之后损伤逐渐扩展到主叶脉中部、次叶脉和叶肉（图16）。

图16. 敌草隆对菜豆叶片光合能力的损伤[11]

2. RGB 彩色 3D 成像分析

彩色成像主要用来分析植物的各种形态学参数。图17为干旱胁迫处理后拟南芥每天的形态学分析图。我们可以明显看到9-10天时，处理组的生长受到了极大的影响，叶片开始枯萎。

图17. 干旱胁迫处理拟南芥的形态学分析图

而通过专业软件进行深入分析后，我们可以得到拟南芥的生长动态变化曲线、叶面积、植物紧密度、周长、叶片细长度（SOL）等二十余项形态学参数，将植物生长过程中的各种形态变化通过一系列量化的指标体现出来（图18）。

图18. 干旱胁迫处理拟南芥的各种形态学参数

同时，彩色成像可以进行不同方向的形态学分析，甚拟合3D形态学模型。帕拉茨基大学的Jan Humplík利用PlantScreen系统研究了两种不同品种豌豆（Terno和Enduro）在低温胁迫的表型变化[12]。他们使用RGB成像测量了7个时间点的总绿色面积、归一化绿色面积和生长速率的变化（图19），发现TER的生长速度要显著高于END。到第21天，TER的总绿色面积增加了3.5倍，而END只增长了2.5倍。

图19.TER植株在21天低温适应中的正面RGB成像图[12]

图20. 盐处理小麦幼苗的热成像图[1]

3. 热成像分析

PlantScreen的热成像模块主要用于获得植物表面温度分布的热成像图。用于各种植物温度变化的研究，如干旱、高温、渗透压、热干风、病害等生物和非生物胁迫以及某些特殊发育阶段造成的植物表面温度分布变化，进而可以反映植物叶片蒸腾情况和气孔导度的差异变化（图20）。

通过在培养液中添加甘露醇模拟渗透压胁迫，处理后的拟南芥因为无法进行正常的蒸腾作用，叶片温度快速升高。生长过程中，对照组的温度一直保持在22-23℃，而处理组的温度竟然比对照组高了将近2℃（图21）。

图21. 渗透压胁迫处理拟南芥的热成像图

4. 高光谱成像分析

PlantScreen的高光谱成像模块主要用于测量植物的反射光谱成像图，在测量的波段范围内可获得几十到上百张不同波段的光谱成像图。这些成像图用来计算如下植被指数：

1) 归一化差值植被指数（Normalized Difference Vegetation Index (NDVI)）

2) 简单比值指数（Simple Ratio Index, Equation: SR = RNIR / RRED）

3) 改进的叶绿素吸收反射指数（Modified Chlorophyll Absorption in Reflectance Index (MCARI1), Equation: MCARI1 = 1.2 * [2.5 * (R790- R670) - 1.3 * (R790- R550)]）

4) ZY化土壤调整植被指数（Optimized Soil-Adjusted Vegetation Index (OSAVI), Equation: OSAVI = (1 + 0.16) * (R790- R670) / (R790- R670 + 0.16)）