高密度无支架培养的 3D 细胞球高通量筛选应用于肿瘤毒性研究

介绍
与传统的 2D 培养模型相比，3D 球体模型能够更好地模拟肿瘤的体内组织结构、基因表达和代谢情况，因此癌症研究的 3D 球体模型越来越受欢迎 1,5,6。先前的研究表明，3D 培养显示出多种体内肿瘤特征，如细胞 - 细胞 /ECM 相互作用、药物外显率、剂量反应和耐药性 7。与实体瘤相似，球状体由外部细胞增殖区、中层静止细胞和内部坏死核心组成，这些坏死核心细胞暴露在缺氧条件下。这些相似之处表明，3D 模型将有助于更好地评估药物安全性，并有助于成功识别抗肿瘤化合物 4。针对 3D 细胞球培养，已经开发了各种各样的技术。原则上，这些方法使用细胞附着抵抗表面或物理力量来促进细胞与细胞的相互作用。旋转培养瓶 /NASA 生物反应器系统使用连续运动来防止细胞粘附在培养瓶表面，从而促进细胞与细胞之间的粘附。磁悬浮法利用磁场将含有纳米颗粒的氧化铁细胞团簇在一起形成球状体。而旋瓶法和磁悬浮法会产生大量的球状体，均匀性差，球状体比例低 2。悬滴法是将细胞悬浮液滴在培养皿的底部。然后将这些液滴中形成的球状体转移到细胞培养板中进行进一步的检测。

优势

• 便于增加每个实验条件下的细胞球数量

• 大量的细胞球可同时培养、染色和成像
• 使用高内涵成像，同时对多个细胞球或类器官进行3D 分析

在没有自动化条件下，这项技术是劳动密集型且时间消耗大，因此限制了它只能在小范围内被研究和应用。目前，一种流行的产生细胞球的方法是使用镀有低附着材料的 u 形底孔的板。这种无支架的方法提供了一个相对简单的工作流程，并与高内涵成像兼容。此外，细胞球尺寸易于控制，球体的均匀度高 2。以前的工作是用一步染色法优化圆形底板的工作流程，这样可以减少分析时间并使变量Z小化 3。然而，使用 u 型底板的一个缺点是，在每个孔中只能生成一个单一的细胞球。为了增加数据点，需要重复的孔，这是一项耗时的工作，Z终会增加试剂和测试化合物的使用量，从而提高筛选成本。

在低附着表面上形成微孔阵列的方法可以产生多个大小一致的细胞球。康宁 ®Elplasia® 板在标准培养板 ( 6 孔、24 孔、96 孔 ) 内设计有微腔。每个孔都涂有极低的附着面，以形成球体。与 u 型板标准工作流程中每个孔生成一个球相比，Elplasia 板在 96 孔中平均每个孔可生成 78个球。这允许在相同的条件下生长和处理多个细胞球，从而Z大化数据输出。此外，该方法可用于研究肿瘤组织的克隆异质性，增加用于基因表达或代谢组学分析的材料数量 5,8。
本文中我们展示了 Elplasia 96 孔板的使用，以及 3D 培养流程，包括球体生成、化合物处理、细胞毒性分析、ImageXpressMicro 共聚焦高内涵成像分析系统的高内涵成像，以及使用 MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件进行 3D 图像分析。能够轻松生成多个球状体，并将工作流程与高内涵成像无缝集成的能力，将在药物发现和化合物毒理学方面有重大应用。

方法
细胞培养
使用 HCT116 细胞系 (ATCC) 生成细胞球。Elplasia 板是预湿的，并根据制造商的 protocol 进行处理。在Elplasia 96 孔板 (#4442) 中，在总共 100 毫升的 McCoy培养基 ( 补充 10% 胎牛血清 ) 中，50,000 个细胞被包裹在 Elplasia 96 孔板 (#4442) 中。细胞在 37℃ 下孵育 24小时，在化合物处理前形成细胞球。在加入化合物之前，细胞在组织培养显微镜上进行肉眼观察，以验证细胞球的形成。本实验中使用了以下化合物：阿糖胞苷，阿霉素 (Dox)，依托泊苷，星孢素和紫杉醇。化合物按照 1:5 稀释，和对照组一起，在重复孔中进行测试。细胞球与化合物共孵育六天，新鲜化合物在第三天加入。
染色
对于活细胞毒性实 验，细胞球用以下染 料的混合物染色，Z终浓度如下：3 μM 的 Calcein AM (LifeTechnologies)、2 μM 的 溴 乙 啡 锭 二 聚 体 III (EthD-III)(Molecular Devices) 和 33 μM 的 Hoechst 33342 (LifeTechnologies)。在使用前立即配制染料溶液，每孔加 10μL。在成像前，细胞球在 37℃ 的染料中孵育两个半小时。

图像采集
图像获取使用 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像分析系统 (Molecular Devices)，使用 10X 物镜。共聚焦转盘的针孔尺寸 = 60 μm。实验中采集了 12 幅图像的Z-stack 图像集，Z 层步阶为 5 μm，覆盖至少一半的细胞球体积。
分析
使用 MetaXpress 软件中的自定义模块编辑器进行 3D 图像分析。通过使用 Hoechst 染色图像与 3D 功能“ 发现球形物体 ”的算法来分析识别球体。采用 Hoechst 染色的细胞核计数模块识别细胞总数。活 / 死模块用于定量死亡细胞 (EthD 阳性 ) 和活细胞 ( Hoechst 阳性，Eth 阴性 ) 的数量。因为死细胞可能不再显示 Hoechst 染色，细胞分类模块用于识别所有 EthD 阳性细胞。利用Z优匹配算法将所有平面上的总细胞、活细胞和死细胞的物体 Mask 连接起来形成三维对象。使用 SoftMax Pro 软件使用 4 参数 logistic 曲线拟合进行剂量反应分析。统计分析和图表用 Microsoft Excel 完成。

结果
典型的无支架产生细胞球的方法是使用超低附 u 型底板，每个孔产生一个椭球体。为了增加数据点，需要重复检测多个孔，这通常是劳动密集型的，并Z终大大增加了筛选成本。Elplasia 的 96 孔板可以在一个孔中形成多达78 个球体，每个球体都安置在一个微腔中。在这些微腔槽中形成的球体在大小和形状上是一致的，从而提高了再现性 ( 图 1 )。该板与 ImageXpress 高内涵成像系统兼容，允许根据所使用的检测方法进行不同的生物信息读出。
细胞球用不同类别的抗肿瘤化合物处理 6 天，然后评估细胞存活率。用 Hoechst ( 细胞核 )、Calcein AM ( 活细胞 ) 和 EthD ( 死细胞 ) 染色 ( 图 2 和图 3 )。为了减少对球体的干扰，简化染色过程，染色液留在孔中，孵育结束后不用清洗掉。为了量化化合物处理对细胞存活率的影响，我们使用具有 3D 分功能的自定义模块编辑器 (CME) 在MetaXpress 软件中对图像进行分析。测量细胞球直径、体积、死亡细胞和活细胞数。

观察化合物处理的细胞毒性和细胞抑制作用。总的来说，我们观察到所有化合物的活细胞数量 ( EthD 阴性 ) 都减少了。死亡细胞 ( EtHD 阳性细胞 ) 数量增加，特别是星孢素和阿霉素处理后，表现出细胞毒性作用。在紫杉醇和依托泊苷的作用下，细胞总数减少，主要表现为在测试浓度下的细胞抑制作用 ( 图 4C 和 4D )。在处理过的细胞球中观察到活细胞的浓度依赖性下降。阿糖胞苷、阿霉素和阿糖胞苷的处理导致活细胞数的浓度依赖性下降，死亡细胞数相应增加。紫杉醇处理的细胞球显示球体的大小减少，但活细胞计数没有减少，表明细胞抑制作用。在较高的紫杉醇浓度 (13.3 μM) 下观察到细胞毒性，同时活细胞数减少 3 倍。

通过测量球体的直径和体积，我们还评估了化合物对球体大小的影响 ( 图 4B )。有趣的是，经化合物处理的细胞球（ 阿糖胞苷、阿霉素、星孢素和紫杉醇 ）与对照样品相比，观察到的直径没有显著差异。然而，与对照组相比，处理后的球体体积明显减少。减少球体体积而不减少直径表明一个坍缩的球体结构，其中三维形态不再保持。由于直径可以通过二维分析来测量，体积和直径的差异表明三维分析对于研究化合物毒性对球体的影响更具有代表性。
虽然球形活细胞的数量可以用来确定引起表型变化的化合物的有效浓度，但 3D 分析的其他检测参数可以提供关于特定影响的额外信息 ( 例如死亡细胞的数量、总细胞数量和荧光强度 )。

图 1 康宁 Elplasia 板可产生多个球体。图中是 96 孔 Elplasia 板中的一个孔。使用 4x 物镜 ( 4 个位点，然后拼接 ) 获取图像。图中展示了透射光和荧光图像。球体大小和形状的可变性常常影响结果的再现性。测量球体的直径和形状因子 ( 圆度的测量，1 表示一个完美的圆 ) 以评估球体的均匀性。图表显示了八个对照孔的平均形状因子和平均球体直径 ( 标准误差 )。

图 2 对照组和化合物处理后球体的代表性图像。细胞球用 Hoechst 染料 ( 蓝色 ) 染色核，用 Calcein AM 染色活细胞 ( 绿色 )，用EthD 染色死细胞 ( 红色 )。使用 z-stack 功能，用 10X 物镜进行成像。显示的结果为Z大投影图像。化合物处理后的细胞球表现出一系列的表型效应，大多数球体失去了紧凑的球状结构，细胞脱离了主球状体。

图 3 用不同浓度的阿糖胞苷和星孢素处理细胞球。注意两种不同化合物造成的球状结构上的不同。阿糖胞苷处理后导致结构不紧密，细胞脱离球体。星孢素处理的结果是分散和扁平的球形形态，有大量的死亡细胞，特别是在高浓度下。

图 4 对细胞球的细胞毒性作用显示为对照和化合物处理的细胞。A) 展示了对照组的单一平面和阿糖胞苷处理 (13.3 μM) 球体的图像分析 Mask。中间一列显示球形和活细胞的 Mask(EthD 阴性 )。右侧列为死细胞 Mask ( EthD 阳性 )。B) 除依托泊苷外，与未加化合物处理的球体相比，经处理的球体直径无明显变化。相比之下，经过处理的球状体体积减少了 20% 到 40%。*p< 0.05， **p<0.01，***p<0.001。阿糖胞苷 (333 μM)、阿霉素 (1.3 μM)、依托泊苷 (333 μM)、星孢素 (33.3 μM)、紫杉醇 (67 μM)。C) 平均每个细胞球中，化合物处理后的活细胞较少，死细胞较多 (p<0.001)。D) 用 4 参数曲线拟合出每个球体的平均活细胞数与化合物浓度的关系。EC 值为：阿糖胞苷 = 0.128 μM，阿霉素 = 0.156 μM，星孢素 = 31.78 μM，紫杉醇 = 13 μM。星孢素和紫杉醇的高 EC 值表明这些化合物在观察到细胞毒性之前具有细胞抑制作用。
结论
我们发现，在康宁 Elplasia 96 孔板中，经过化合物处理、染色，然后在 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵系统上成像，可以很容易生成多个球状体。使用 MetaXpress 软件对细胞球进行三维图像分析，可以定量评估化合物对球状体的效应。这样的从样本制备到结果分析的完整工作流程已经优化为可应用于 3D 培养的快速高通量药物筛选。