高内涵成像分析系统用于线粒体动力学检测和表型分析

概述
线粒体是细胞的主要能量来源，在调节细胞代谢中起着重要作用。线粒体可以根据环境条件和细胞需求改变其结构来调节自身的形态，其动力学本质是由分裂、融合、自噬和生物发生几个过程驱动。线粒体分裂产生大量的圆形碎片，尺寸较小；融合产生的线粒体数量较少，形状细长且尺寸较大。线粒体分裂和融合的相对过程都参与到线粒体质量控制和正常细胞稳态的维持过程中 [2，3]。线粒体分裂和融合对细胞的正常功能都至关重要。
线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，是正常线粒体循环的重要组成部分。线粒体受损或衰老时会发生不对称裂变。当
健康的成分被运送到新的线粒体时，受损的成分将被分离成小的组分，这些小的组分被去极化并通过线粒体自噬小体迅速清除 [4]。生物发生是导致新的线粒体成分合成的过程。线粒体动力学的病理改变可导致生物能量功能受损和线粒体介导的细胞死亡，并与多种病理机制相关，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺动脉高压，帕金森氏病和亨廷顿氏病以及骨骼肌萎缩症或阿尔茨海默氏病 [1,5]。由于线粒体本身有限的糖酵解能力和高水平的能量使用，神经元对线粒体功能的改变特别敏感 [6]。心肌细胞是线粒体体积分数最高的细胞之一，对线粒体动态变化也特别敏感 [7,8]。线粒体动态改变在许多癌症中也发挥作用，其中线粒体融合可以降低细胞对凋亡信号的敏感性，诱导有氧糖酵解 (Warburg 效应 )，并可能通过减少凋亡细胞死亡而促进癌细胞生长 [9]。
主要特点
• 获得高质量的图像，更好地显示线粒体形状和结构的变化
• 以更有效、更精确的方式量化和测量线粒体的表型变化
• 了解疾病的机制并评估各种细胞模型中的化合物毒性

研究表明，线粒体动力学的改变可以促成应急刺激的正常生理反应。在运动期间，骨骼肌的线粒体碎片能维持活跃的体
内平衡；恢复过程中，线粒体融合被激活，并维持稳定。

目前，科研界对使用高内涵成像方法研究线粒体结构重塑的兴趣日益浓厚。共聚焦成像和水镜可以提高成像质量并更好地显示线粒体结构，而这些图像分析工具可以获得不同表型的数字特征。本研究中，我们阐述了线粒体表型和结构重排的分析模块可用于线粒体动力学为基础的细胞研究。
材料
PC12 ( 人神经母细胞瘤细胞 ) 获自 ATCC，Hoechst 33342 和MitoTracker ( 橙色 ) CMTMRos 均从 Thermo Fisher 购买。化合物购自 Sigma。将 PC12 细胞以每孔 3,000 个细胞的密度接种 于 384 孔板(Greiner) 中。第二天，用不同浓度的化合物处理细胞 18 小时，包括氯喹 (0 – 100 µM)，鱼藤酮 (0 – 10 µM)，缬氨霉素 (0 – 1 µM) 和甲基汞 (0 – 10 µM)。每种化合物均以七种不同浓度 ( 对数稀释 ) 以四个复孔进行测试，样本大小为n=8。处理后，将活细胞用线粒体染料 Mitotracker OrangeCMTMRos 和 Hoechst 33342 核染料 ( 分别为 0.2 µM 和 0.5µM ) 染 色 30 分钟，并用 ImageXpress Micro Confocal 系统(Molecular Devices) 成像。使用共聚焦模式和 40X 水镜拍摄活细胞的图像。每个孔取三到四个视野。为了获取更好的检测性能，用 Z 轴层扫的功能以 0.6-1 微米的间隔获取 3-4 个图像。用 DAPI 通道和 TRITC 通道分别在 100 毫秒和 400 毫秒的曝光下对细胞核和线粒体成像。使用 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件中的自定义模块编辑器分析图像。( 详细信息在结果部分中进行了详细描述 )。一般来说，使用“ 查找纤维 ”模块来识别细长的线粒体，使用“ 颗粒度 ”模块以获得更多的圆形颗粒，识别出具体的计算对象后，使用 Excel或 SoftMax Pro Software 曲线拟合工具完成了二级分析。使用公式 Z ′ = 1-3 *(STDEVcontrol +STDEVexperiment)/(AVEcontrol- AVEexperiment) 计算 Z’值。
结果
表征线粒体的完整性和形状对理解疾病机制和评估毒性很重要。线粒体的数量、亮度、大小、长度和形状在线粒体循环过程中发生变化，可能预示着细胞健康和代谢的变化，或先于细胞凋亡的过程。我们将对照组 PC12 的线粒体表型与已知影响线粒体变化的化合物作用进行了比较：氯喹能抑制线粒体循环，鱼藤酮 ( 氧化磷酸化的抑制剂 ) 和缬氨霉素 ( 钾离子载体 ) 会破坏线粒体膜电位。用不同浓度的化合物处理细胞，四个复孔，处理 18 小时并用 Mito Tracker Orange 和 Hoechst染料对细胞进行染色。用 40X 的水镜在共聚焦模式下对细胞成像，可以分辨单个线粒体并监测线粒体形状的变化。图 1 和图 2 显示对照样品和经化合物处理的样品的线粒体图像。例如，注意图 2 所示的线粒体表型的变化。对照组细胞的线粒体纤维延伸较长，缬氨霉素处理导致线粒体碎裂，呈小点状，鱼藤酮处理引起细胞核周围线粒体破碎和凝结。重要的是，缬氨酸霉素和鱼藤酮都引起线粒体电位的损失，表现为线 粒体荧 光强 度的降 低 ( 图 2 )。肉眼 观 察 氯 喹的作用不明显，但 通 过图像分析测定，形态发生了明显变化 ( 见下表 )。我们观察到化合物效应的浓度依赖性 ( 图 2 )。在较低浓度的化合物中，形态变化明显。高浓度的化合物导致线粒体膜电位的损失、线粒体的破坏和细胞的程序性死亡。

图 1 线粒体形状的表型分析。 用 MitoTracker Orange 和 Hoechst 将 PC12 染色 15 分钟，并使用 40X 水镜以共聚焦模式成像。使用 MetaXpressCustom Module Editor 的 Granularity（A）和 Find Fibers（B）模块分析图像。 A. 细胞核显示为蓝色，完整的线粒体显示为黄色。右侧图像白色显示了用于细胞核和线粒体（ 颗粒 ）的模拟图层。B. 黄色的线粒体图像用图像锐化算法（TOP-Hat）进行了预处理。右侧图像显示了“ 纤维 ”结构的模拟图层。

图 2 化合物对线粒体的作用。 顶部窗口显示了 MitoTracker CMTMRos 线粒体染色（ 黄色 ），用于对照 PC1（A），用 100 nM 已知可破坏线粒体结构的化合物处理 18 小时：缬霉素（B）和鱼藤酮（C）。使用具有共聚焦模式的 40X 水镜和对细胞进行成像。调整图像的亮度，以更好地显示线粒体。注意线粒体形状的变化 : 缬氨霉素使线粒体线分裂成更小的颗粒，鱼藤酮使线粒体缠绕和塌陷。使用 MetaXpress 自定义模块编辑器分析图像。底部窗口中的分析模拟图层显示了线粒体颗粒（ 粉红色 ）和纤维结构（ 黄色 ），核（ 深蓝色 ）和细胞体（ 浅蓝色 ）。

图 3 用氯喹（ 可抑制线粒体再循环 ），鱼藤酮（ 氧化磷酸化抑制剂 ）和缬氨霉素（ 钾离子载体，可破坏线粒体膜电位 ）处理 PC12 细胞。 用指定浓度的化合物处理细胞 18 小时，做四个复本。如图 1 和 2 所示，对细胞进行染色和成像。图像分析将线粒体结构确定为“ 纤维 ”( 顶部 ) 或“ 颗粒 ”( 中部 )。EC50 的值取决于四个浓度依赖性复本和参数曲线的拟合。附加图表示线粒体染色后荧光强度的变化。绿色是氯喹，红色是鱼藤酮，蓝色是缬氨霉素。
MetaXpress 软件可以做形态测量。我们利用“ 定制模块编辑器 ”查找和表征可以定义为“ 颗 粒 ”或“ 纤 维 ”的对
象。颗粒由“ 颗粒度 ”模块定义；纤维结构或段可以由“ 查找纤维 ”模块确定。根据用户应用不同来定义对象，例如最小或最大宽度和局部背景的强度。图像预处理 ( 锐化 ) 是可选步骤，可以 更 好的定 义 纤 维 ( 图 1 )。MetaXpress 可以为每个对象定义数量、面积、强度、长度、和形状，并以每个视野或每个图像的形式表示为数值的平均值或总和 ( 图 2 )。这些检测结果可以用数字来表征线粒体结构动力学 ( 图 4 )，以及计算剂量反应和各种化合物的有效浓度 ( 图 3 )。具体来说，用已知的有线粒体毒性的药物处理细胞不仅导致线粒体电位降低 ( 检测为线粒体包括颗粒和纤维的数量减少和荧光强度降低 )，而且还改变了总纤维长度和平均纤维长度，尤其是用缬氨霉素治疗时更为明显 ( 图 4 )。与此同时，抑制线粒体循环的氯喹处理导致线粒体积聚，因此增加了纤维数量。表 2 比较了对照样品和化合物处理样品的不同测量值。给出了单个（ 中间 ）浓度的化合物的数据：20 µM 氯喹，300 nM鱼藤酮和 100 nM 缬霉素。鱼藤酮和缬氨霉素治疗后，线粒体纤维的数量和长度出现明显的剂量依赖性降低，而氯喹则产生相反的作用。通过粒度分析，可以确定缬氨霉素和鱼藤酮减小了颗粒数量和面积。该方法可以获得各种测量值，并且这种多参数方法可用于定义信号传导途径对复杂生物发生多方面的影响。

在分析过程中，我们比较了水镜和空气镜对图像质量和分析的影响。值得注意的是，使用水镜可以提高图像质量，并且通常会导致 Z' 值增加（ 表 3 ）。本分析在纤维和颗粒之间并非是排他性的，因此，推荐对纤维和颗粒进行独立计数。图 4 中显示了所使用的定制模块的描述。可以针对特定的细胞类型或疾病模型进行调整和进一步修改。

图 4 自定义模块编辑器 (CME)。 用自定义模块编辑对线粒体表型进行计数和分析，以评估线粒体的健康、代谢、循环、复合效应和疾病状态的含义。
该模块包括以下步骤 :
1. 粒度模块用于检测线粒体颗粒。
2. 用 Top hat 算法预处理线粒体图像。
3. 用 find fibers 模块，检测线粒体粒子及其裂变和聚变。
4. 单阈值检测细胞个体。
应用 CME 可以识别每个对象的特定参数来确定每个图像或每个区域的对象总和。相关的检 测取决于具体的应用。最常用的检 测指标如下 :
1. 细胞核计数 ( 细胞计数 )
2. 核平均区域 / 平均强度
3. 总颗粒数 ( 每个视野 )
4. 细胞颗粒数 ( 每个细胞 )
5. 颗粒面积，平均颗粒面积，颗粒光强度或整体颗粒光强度
6. 总纤维量 ( 每张图像 )
7. 细胞纤维量 ( 每个细胞 )
8. 平均纤维长度，纤维长度和纤维光强度

结论
本研究阐述了使用高内涵成像和高级图像分析的线粒体动力学分析方法，该方法能够量化线粒体的表型变化，并且可以用于研究正常和病理结构变化以表征疾病模型或复合效应。自动成像可适用于各种细胞模型中化合物的药物开发或毒性评估。