多参数 THP-1 细胞分化及细胞因子分泌表型分析试验评价抗炎化合物

介绍
巨噬细胞起源于血液中的单核细胞，这些单核细胞离开血液循环，分化成不同的组织。巨噬细胞参与细菌和受损细胞的检测和吞噬。此外，巨噬细胞通过释放细胞因子引发炎症，细胞因子激活血管细胞，促进细胞因子粘附血管并迁移到组织中。分化的 THP-1 细胞已被广泛用于体外巨噬细胞模型研究巨噬细胞参与炎症反应。人单核细胞系 THP-1 可以通过佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯 (PMA) 分化成巨噬细胞，并通过 LPS 活化。活化的 THP-1 细胞改变形态，分泌炎性细胞因子。监测细胞因子的表达水平是炎症细胞模型的重要生理指标。我们提出了多参数细胞分析的结果，使用表型成像考察巨噬细胞形成和低体积ELISA 分析细胞因子的分泌，以评估药理学化合物对炎症反应的影响。PMA 和 LPS刺激 THP-1 细胞 48 小时。PMA 和 LPS 激活 THP-1 细胞后，IL-8、IL-1b 和 TNF-a升高。为了评估抗炎化合物，细胞在激活前分别接受激酶抑制剂 SB202190 和 PDTC以及抗生素莫西沙星的处理。然后，通过定量细胞因子分泌量来测定这些抗炎化合物对炎症反应的抑制作用。利用表型成像观察了巨噬细胞形成的影响。与报道的作用机制一致，化合物 SB202190、PDTC 和莫西沙星的细胞因子表达呈浓度依赖性下降。

实验背景
THP-1 细胞分化成巨噬细胞被量化测量的贴壁细胞数量使用 ImageXpress Pico 个人型高内涵成像分析系统。采用基于低体积微流控技术的 PuMA 系统 ELISA 定量测定细胞上清液中 IL-8、IL-1b 和 TNF-a 的含量。PuMA 系统运行 ELISA 小样本量( 10-20 µl，现有抗体对 )。这增强了测量上清体积有限的多个细胞因子的能力。结合成像和低体积 ELISA 提供了一个有效的多参数分析系统，可以用来测试抗炎化合物的有效性，并提供对作用机制的深入了解。

仪器
PuMA 系统是一种实用的、价格合理的台式仪器，它使用您自己的抗体或预涂覆的流线型工作流程中的流芯片来运行 ELISA分析。PuMA 平台被设计成无缝地适应您当前的实验室工作流程
• “放手”情况下，在不到3小时内运行完整的 ELISA
• 将样品和试剂体积减少到 10-20µl
• 与您现有的 ELISA 试剂盒和抗体对一起工作
ImageXpressPico 个人型高内涵成像分析系统包括：
• 6 种可选荧光通道 + 透射光
• 环境控制模块
系统通过 CellReporterXpress™ 成像和分析软件进行控制
SpectraMax iD5 多功能酶标仪是用来测量吸光度，计算浓度和 EC50 值

炎症实验
多参数炎症试验的方案如下。经刺激后，分化的 THP-1 细胞贴附于平板，分泌上调的细胞因子。THP-1 分化导致的表型变化如图 2 所示。PMA 和 LPS 刺激细胞因子分泌增加如图 3 所示。
• THP-1 细胞每 96 孔铺 2 万个细胞，孵育48 小时。然后用 PMA 和 LPS 混合刺激24 小时 (0-5 pg/mL PMA, 0-100 pg/mLLPS)；均来自 Sigma。

图 2. 非贴壁细胞去除前后的受刺激或未受刺激 THP-1 细胞图像。上:未受刺激 ( 左 ) 和刺激后 ( 右 )THP-1 细胞的透射光图像。底部：缓冲液冲洗的细胞培养。细胞计数的分析掩模显示为白色。

• 在细胞因子刺激前 2 小时加入抗炎化合物
• 孵育后，每孔取上清 60 µl 进行 ELISA 分析。样本的分析是新鲜的或者是储存在- 70c的，用于后续分析。
• 使用 ImageXpress Pico 系统透射光(TL) 模式对细胞进行成像。成像前，非粘附细胞用培养基冲洗 2 次。细胞以 TL计数。
• 在实验缓冲液中以 3:1 稀释上清，使用PuMA 系统流式芯片和试剂 ( 均来自BioLegend ) 对 IL-8、TNFa 和 IL-1b 进行分析。

图 3. 细胞因子分泌的增加是 LPS 浓度的作用。表中列出了Z低 ( 未受刺激 ) 和Z高 ( 刺激后 ) 时 IL-8、IL- 1b 和 TNFa 的含量。
低体积自动化 ELISA
微流控分析的优点包括减少了试剂的使用和更快的结果呈现。在 Pu•MA 系统工作流程中，所有试剂预先装入流式芯片中，然后通过形成免疫复合物的检测通道自动发送。所有清洗步骤都集成到 protocol 中。protocol 完成后，通过读取酶标仪上的吸光度值来进行量化。

图 4. 自动化 Pu•MA 系统的 ELISA 工作流程和 ELISAprotocol 中自动化检测步骤的示意图。微流控检通道为捕获抗体提供了坚实的支持。

抗炎药物
炎症是由带有细胞因子的受体的激活引发的一系列信号事件。激酶激活转录因子上调粘附分子和细胞因子(标志物)。不同的标志物受不同的途径和转录因子控制。我们研究了三种影响炎症通路不同部分的已知化合物，并测量了五种标志物的反应。
• SB202190，一种 p38MAPK 抑制剂，作用于 JAK/STAT 和 NFkB 通路2
• PDTC，一种抗氧化剂，抑制 NFkB 的活化3
• Moxiflo• 用抗炎化合物处理 THP-1 细胞 4 小时，然后用 5pg/ml PMA 激活 THP-1 细胞，用 100pg/ml LPS 刺激 THP-1 细胞
• 采用 Pu•MA 系统 ELISA 和 SpectraMaxiD5 酶标仪检测上清液中细胞因子的水平
• 非贴壁细胞冲洗后，成像计数贴壁细胞数量
• 使用 SoftMax Pro 软件 4 参数曲线拟合计算 EC50 值

结论
• 我们展示了一种多参数炎症检测方法，使用 THP-1 细胞模型和自动化细胞成像，以及一种新型微流体ELISA系统。
• Pu•MA 系统使用微流控芯片对现有 ELISA抗体对进行免疫分析，减少试剂的使用，提高反应时间
• 对三种不同炎症标志物对三种抗炎化合物的反应进行了表征。观察到的行为差异与已发表的行为机制一致。