使用 ImageXpress Pico 个人型高内涵系统分析细胞自噬

介绍
自噬及其失调已被发现在神经退行性疾病和癌症中发挥重要作用，因此在这一过程中发现新的治疗靶点已成为一种有前途的药物治疗方法。自噬是在细胞应激反应中降解和循环受损蛋白质和细胞器的调节过程 1,2 。这种被称为自噬体的囊泡是通过在标记为破坏的细胞成分周围形成双膜来组装的 1 。然后自噬小体囊泡与溶酶体融合，将其内容物通过溶酶体水解酶降解。自噬具有多种复杂的生理和病理生理作用，如对营养饥饿的适应、细胞内蛋白和细胞器受损的清除、细胞发育、抗衰老、微生物清除、细胞死亡、肿瘤抑制和抗原呈递等 2 。线粒体自噬是线粒体自噬的选择性降解。这个过程经常消除细胞损伤或应激后线粒体缺陷。
材料
• PC12 人神经母细胞瘤细胞系 (ATCC)
• 384-孔微孔板 (Greiner)
• Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZO Life Sciences)
• MitoTracker Orange(ThermoFisher Scientific)
• Hoechst (ThermoFisher Scientific)
• ImageXpress™ Pico 个人型高内涵成像系统(Molecular Devices)
• CellReporterXpress™ 自动成像分析软件(Molecular Devices)

方法
本文中，我们评估了 ImageXpress Pico 个人型高内涵成像系统检测和定量分析自噬体粒子的效率。以 PC12 人神经母细胞瘤细胞系为模型进行实验研究。在 6,000 个细胞/孔的条件下，将细胞种在 384 孔板中，孵育 48 小时，通过不同浓度的氯喹或维拉帕米处理细胞，评估自噬作用 48 小时，维拉帕米诱导自噬，氯喹抑制自噬体降解，导致粒子积累。治疗后，使用细胞自噬检测试剂盒对活细胞进行染色，追踪自噬小体。此外，MitoTracker Orange染料用于检测线粒体和 Hoechst 确定核 ( 分别为 0.2 μM 和 1 μM )。使用 ImageXpressPico 系统的 20x 或 40x 物镜和三个检测相应染料的通道 ( FITC、TRITC 和 DAPI ) 拍摄图像。每孔在 20x 物镜下获得一张图像，而每孔在 40x 物镜下获得 2 - 4 张图像，以确保可靠的统计结果。使用 CellReporter Xpress 图像采集和分析软件中的自噬或线粒体应用模块对图像进行分析。该算法利用核标记物对细胞进行分割，检测和表征细胞胞质中的自噬小体或线粒体等小物体。检测自噬的定量测量包括颗粒总量或平均数量、颗粒总量或平均面积 ( 亚细胞物体 ) 以及荧光强度测量。代表性的图像和分析标识氯喹 (30 μM) 处理的细胞如图1 所示。检测氯喹和维拉帕米的浓度反应，并评价 EC50 值。氯喹和维拉帕米处理后自噬水平分别增加了 4.6 和 3.3 倍，由总自噬小体的数量来计算 ( EC50 值分别为 4.0和 3.6 μM )。

优势
• 量化自噬过程中的化合物效应
• 使用核标记对细胞进行分割时，检测和表征小型目标物
• 使用自动化成像分析确保可靠的统计结果

结论
该方法可用于检测自噬颗粒，可用于检测化合物对自噬过程的影响。