使用定量发光试验检测病毒诱导的细胞病变效应

简介
病毒感染哺乳动物细胞通常会降低细胞活力，并对细胞造成明显的影响，如形状或大小的改变，或与邻近细胞融合。这些变化被称为细胞病变效应 (CPE)，可以通过光学显微镜或成像系统对细胞病变效应进行评估，或者使用更多的定量检测手段对其进行测定。
Promega 公司的 Viral ToxGlo 检测试剂盒可以检测活细胞中存在的 ATP，并提供一种简单的发光检测方法来定量细胞
活力。由于病毒诱导的 CPE 会耗尽细胞中的 ATP，导致发光信号的减少，因此可以定量检测宿主细胞中病毒诱导的 CPE。使用简单的混合读取工作流程，即可轻松地在 SpectraMaxiD5 多功能微孔板读板机上检测到试验结果，并使用 SoftMaxPro 软件进行分析 ( 图 1 )。
这里，我们展示了如何使用 Viral ToxGlo 检测试剂盒来测定病毒感染的哺乳动物细胞中的病毒感染力和半数组织培养感
染剂量 (TCID50)，以及如何测量化合物的抗病毒效力。本研究采用了之前描述的两种病毒感染模型 : 甲型 H1N1 流感病。

优势
• 简单的混合和读取方法，添加试剂后仅需 10 分钟即可获得结果
• 适用于筛选的稳定、灵敏的发光读数
• 使用 SoftMax Pro 软件自动生成数据和分析结果

材料

• Viral ToxGlo 检测试剂盒 (Promega cat. #G8942)
• MDCK (NBL-2) 细胞系 (ATCC cat. #CCL-34)
• MRC-5 细胞系 (ATCC cat. #CCL-171)
• 生长培养基 ( 用于 MDCK 和 MRC-5) : MEM (Corning cat.#10-010-CV) + 10% 胎牛血清 (FBS, Avantor Seradigm cat.#1500-500) + 青霉素 / 链霉素 (Thermo Fisher cat. #15070-063)
• 甲型流感病毒 (H1N1), (ATCC cat. #VR-95PQ)
• 人类冠状病毒 229E (ATCC cat. #VR-740)
• 利巴韦林 (Sigma cat. #R-9644)
• 瑞德西韦 (MedChemExpress cat. #HY-104077)
• 96 孔白色、组织培养处理过的透明底微孔板 (Corning cat.#3610)
• Nunc 白色密封胶带 (ThermoFisher cat. #236272)
• SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices)

方法
TCID50 测定
病毒感染力和组织培养感染剂量 (TCID) 的测定可以通过制备病毒原液的系列稀释液，并将这些稀释液添加到目标细胞中
暴露特定的时间来确定。在暴露结束时，使用 Viral ToxGlo可以测定细胞活力的指标 ATP。TCID50 或 50% 细胞病变效应(CPE) 指能引起细胞活力降低 50% 所需的病毒稀释度 ( 病毒量 )。该值被用于后续对抗病duyao物效力的研究。
将细胞以 10,000 个细胞 / 孔的比例接种在底部透明的 96 孔白色微孔板中。细胞在 37℃ 和 5% CO2 条件下附着并过夜生长。在培养基中对病毒原液进行 1:1000(H1N1) 或 1:5(HCoV-229E) 稀释。在细胞板中进行半对数 ( 3.16 倍 ) 系列稀释，将46 µL 初始病毒稀释液添加到第 1 列的孔中 ( 初始体积为 100µL/ 孔 )。然后将 46 µL 从第 1 列转移到第 2列，依此类推到第 10 列。从第 10 列的孔中取出 46 µL，使所有实验孔的体积保持在 100 µL/ 孔。包括无病毒和无细胞对照孔。细胞与病毒在 37℃ 和 5% CO2 条件下孵育 3 天 (MDCK/H1N1) 或 6 天(MRC-5/HCov-229E)。

使用 Viral ToxGlo 试剂盒测定细胞病变效应。病毒处理 3 天或 6 天结束时，在检测孔中加入 ATP 检测试剂，将微孔板在室温孵育 10 分钟使细胞裂解。读数前，将 Nunc 白色密封胶带放置在每个透明底微孔板的底部，以Z大限度地提高发光信号。设置如表 1 所示，在 SpectraMax iD5 微孔板读板机上读取数据。

表 1 使用 SpectraMax iD5 微孔板读板机进行 Viral ToxGlo 检测的参数设置。在 SoftMax Pro 软件的板部分中进行特定设置。通过选择“ 更多设置 ”下“ 显示预读优化选项 ”(‘Show Pre-ReadOptimization Options’) 优化读取高度，并按照读取开始后出现的说明进行操作。

使用 SoftMax Pro 软件中的 4 参数曲线拟合将结果绘制为RLU 与病毒稀释因子的曲线，并从这些曲线中获得每种病毒在其各自细胞系上的 TCID50 值 ( 图 2 )。将 H1N1 病毒原液稀释 999000 倍后，MDCK 活力降低了 50%。而将 HCoV-229E病毒原液稀释 43 倍后，MRC-5 细胞的活力也发生了类似的降低。

复方抗病毒效力的测定
为了评估化合物利巴韦林和瑞德西韦在降低病毒处理细胞的细胞病变效应方面的有效性，将 MDCK 或 MRC-5 细胞以每
孔 10,000 个细胞的数量接种在 50 µL 培养基中，并置于底部透明的 96 孔白色微孔板中。包括只含有培养基的无细胞对照孔。细胞在 37℃、5% CO2 培养箱中附着和过夜生长。在 MDCK 细胞中加入 1000 µM ~ 0.02 µM 的 1:3 连续稀释的利巴韦林 25 µL。在 MRC-5 cells 细胞中加入 17 µM ~ 0.003µM 的 1:3 连续稀释的瑞德西韦 25 µL。将导致细胞病变效果超过 TCID50 的Z佳细胞病变效应的原病毒稀释液 (H1N1 为1:1000,HCov-229E 为 1:5)，分别加入 MDCK 或 MRC-5 细胞，体积为每孔 25 µL。为了确定化合物的脱靶细胞毒性，将利巴韦林或瑞德西韦加入到没有病毒的细胞中，使用上述相同的稀释倍数。处理过的细胞板在 37℃ 和 5% CO2 条件下孵育3 天 (MDCK) 或 6 天 (MRC-5)。
细胞与病毒和化合物孵育后，将 Viral ToxGlo ATP 检测试剂加入检测孔中，并将微孔板在室温下孵育 10 分钟，使细胞裂解。在 SpectraMax iD5 微孔板读板机上读取发光信号之前，在透明底微孔板底部放置 Nunc 白色密封胶带 ( 设置，见表 1 )。使用 SoftMax Pro 软件中的 4 参数曲线拟合将结果绘制为RLU 与化合物浓度的曲线，并从曲线中获得每种化合物的EC50 值。利巴韦林可以部分挽救暴露于 H1N1 病毒的 MDCK细胞的活力，EC50 为 89 µM ( 图 3A )。然而，当使用浓度大于100 μ M 的利巴韦林处理没有病毒的细胞时，可以观察到毒性作用。暴露于 HCoV-229E 的 MRC-5 细胞经过瑞德西韦处理后，细胞活力几乎完全恢复，EC50 值为 215 nM ( 图 3B )。瑞德西韦的脱靶效应很小，仅在 16 µM 以上时可见。