使用 ELISA 方法检测大麻中总的黄曲霉毒素

介绍
Cannabis sativa在美国许多州变得合法化，州立机构正在为种植者、零售商、检测实验室制定自己本地的法规和要求。比如，2019 年 1月，加州在当地法律基础上，开始实施Cannabis sativa相关法规，所有的Cannabis sativa商品都必须经过检测，以确保消费者安全。Cannabis sativa中的潜在污染物包括霉菌毒素，曲霉菌属真菌的有毒产物，食用后可导致人类或动物患病和死亡。加州Cannabis sativa管控局要求对Cannabis sativa产品进行最常见和最危险的霉菌毒素测试：黄曲霉毒素 B1, B2,G1, G2，赭曲霉素 A。这些毒素的上限是 20 ppb，与 FDA 对大多数食品规定的水平相同。其他州对黄曲霉毒素水平有自己的要求。
试纸条检测 (Strip test) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是两种常见的、成本相对较低的食品和饲料样品中霉菌毒素检测
方法。ELISA 是 在 96 孔板上操 作，具有高通量的优 点；而在试纸条上，一 次只能检测两个样品。AgraQuant Total
Aflatoxin 4/40 ELISA kit (Romer Labs) 试剂盒可用于定量食品和饲料成分中的黄曲霉毒素，具有同时检测 44 个不同样品的能力，当需要检测大量的样品时，可以节省大量的时间。在此，我们阐述了 AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA 试剂盒如何与 SpectraMax ABS Plus 酶标仪、SpectraMax iD5多功能酶标仪联用，检测最常见的Cannabis sativa产物之一 - 花当中的黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2 的水平。样品的制备和 ELISA 的一般流程如图 1 所示。

优点
• 节约时间和成本，高通量、低成本的 ELISA 方法，
• 在单个提取产物中分析多种黄曲霉毒素，
• 使用 SoftMax Pro 软件可以快速评估数据结果。

材料
• AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA 试剂盒 (Romer Labs cat. #10002098)
• AflaStar R Rapid Clean-Up IAC 柱子(Romer Labs cat. #10001963)
• Aflatoxin B1 Standard 标准品 (Sigma cat. #34029)
• Cannabis flower Cannabis sativa的花卉 ( 加州药房获取 )
• Methanol, HPLC grade 甲醇，HPLC 级 (Sigma cat. #34860)
• Ammonium acetate 醋酸铵 (Sigma cat. # 73594)
• SpectraMax ABS Plus 酶标仪 (Molecular Devices)
• SpectraMax iD5 多功能酶标仪 (Molecular Devices)

方法
制备样品
将Cannabis sativa样本放在一个塑料袋里，用手压碎。称量 1 克样本并将其放入 4 个 50 mL 的锥形管中。然后在样本中分别添加 0、10、20 和 30 ppb 黄曲霉毒素 B1 标准品。再加入 20 mL 70%甲醇至样本中，剧烈涡旋 3 分钟。所得提取物通过 Whatman1 级滤纸过滤到干净的 50 mL 锥形管中。在每一个提取、过滤得到的样品中，吸取 4 mL 至干净的锥形管中，并加入 20 mL 去离子水。总的 24 mL 溶液通过免疫亲和层析柱 (IAC) 纯化。样品中的黄曲霉毒素与层析柱中的抗体选择性结合。用 20 mL 0.5 M 醋酸铵冲洗柱子，将未结合的物质冲洗掉。最后用 1 mL 100% 甲醇洗脱样品，收集于干净的试管中。
黄曲霉毒素 ELISA 检测方法
每个标准品和待测样品的稀释孔放置于微孔板条固定器中，重复三次实验。将等量抗体包被的微孔放置在单独的板条固
定器 ( ELISA 板 ) 中。未使用的微孔放回带有干燥剂的铝箔袋中。每个稀释孔加入 100 uL 的偶联物，然后加入 50 uL 黄曲霉毒素标准品或待测样品。根据试剂盒方案，偶联物与样品保持2:1 的比例。孔内溶液用 8 通道移液器混合均匀。每种稀释溶液取 100 uL 转移到 ELISA 板的抗体包被过的微孔中，室温孵育 15 分钟。孵育后，用去离子水清洗 ELISA 板 5 次。向板中加入100 uL 底物，室温孵育 5 分 钟。 加入 100 uL 终止液，用SpectraMax ABS Plus 和 SpectraMax iD5 酶标 仪测量样品在 450 nm 波长下的吸光度。

结果
用 SoftMax Pro 软件绘制黄曲霉毒素标准曲线，由 4、10、20 和 40 ppb 标准品组成 ( 图 2 和图 3 )。软件计算每个标准品的结合百分比 (%B/B0)。B 是每个标准品的平均吸光度值(OD)， B0 是 0 ppb 标准品的平均吸光度值。不含抗原的孔(B0) 吸光度值最大。

图 2 在 SoftMax Pro 软件中绘制黄曲霉毒素标准曲线。 黄曲霉毒素标准品在 4、10、20、40 ppb 的 Log(B/B0) vs. Log (Concentration)。R2 =0.997。标准曲线的数据由 SpectraMax ABS Plus 酶标仪测得。

图 3 黄曲霉毒素标准品曲线在 4、10、20、40 ppb 的 Log(B/B0) vs.Log (Concentration)。 R2 = 0.998。标 准 曲 线 的 数 据 由 SpectraMax iD5 多功能酶标仪测得。
使用 SoftMax Pro 软件中的公式编辑器和分组表格计算 %B/B0 值和 Log (B/B0) 值。这些分析方法建立好后，保存为软件中的模板，便于在将来的实验中自动化分析数据结果。待测样本中黄曲霉毒素的百分回收率通过标准曲线测得。10、20、30 ppb 的三个待测样本测得回收率在 71% 至 112%，符合推荐的标准 ( 表 1 )。

结论
相比于检测试纸条等方法，酶联免疫吸附试验易于使用，灵敏度高，可以处理大量的测试样品。AgraQuant Total
Aflatoxin 4/40 ELISA 试剂盒能够定量黄曲霉毒素的水平，以确保食品和饲料产品的安全。此实验方法可用于检测添加有黄曲霉毒素标准品的Cannabis sativa花卉提取物中的黄曲霉毒素回收率。使用 SpectraMax ABS Plus 和 SpectraMax iD5 酶标仪获取数据。使用 SoftMax Pro 软件分析结果，证实待测样品与添加了黄曲霉毒素标准品的样本中的黄曲霉毒素含量一致。