使用 ScanLater Western Blot protein Ladder 估算蛋白分子量

简介
ScanLater Western Blot Protein Ladder 是 ScanLater Western Blot 检 测系 统 的重 要 组 成部分。该 protein ladder的主要应用包括蛋白质分子量的估计，凝胶电泳的可视化，以及从凝胶到印迹转移过程的评价。ScanLater Western Blot Protein Ladder 由 7 个生物素化的重组蛋白以及 3 个预先染色的标记蛋白组成。生物素化蛋白的检测是通过在二抗步骤的印迹中加入铕标记的链霉亲和素来实现的。 在 SpectraMaxi3 或 SpectraMax Paradigm 多功能微孔板读板机上，使用ScanLater Western Blot 检测卡盒读取印迹。
ScanLater Western Blot Protein Ladder
ScanLater Western Blot Protein Ladder 由 7 个 生物素化的重组蛋白组成，分别为 10、20、40、50、80、100 和 140 kD。用铕标记的链霉亲和素孵育的印迹检测它们，当用 ScanLaterWestern blot 检测盒读取时，它们显示为浅色条带 ( 图 1, 左 )。此外，在 18、31 和 70 kD 处有三个可见的预染色标记蛋白 ( 图1，右 )。这些蓝色条带在电泳凝胶和转移后的印迹上可见。当用扫描 Western Blot 检测系统读取 ladder 时，它们也被视为暗条带。
生物素化 ladder 蛋白的分子量与其在凝胶上的迁移距离之间的线性关系在图 2 中与参考标准进行了比较。

优点
• 一套标准包含了可视化凝胶和加入了 TRF 检测的印迹排列的标记
• 生物素化蛋白
• 检测蛋白的分子量可以被估计
• 不需要混合或加热

图 1 ScanLater Western Blot Protein Ladder。 白色条带是生物素化的蛋白，用来估计印迹蛋白的分子量。 它们与铕 - 链霉亲和素孵育后被检测，并在 ScanLater Western Blot 检测系统上读取。暗条带是预先染色的蛋白质，用于监测蛋白质电泳、印迹定位和评估转移效率的进展。在这些过程中，它们以蓝色带的形式出现。

图 2 迁移 vs. 分子量。 在 ScanLater Western Blot Protein Ladder 中，7 个蛋白的迁移距离被绘制出来，并作为它们各自的分子量的函数进行拟合。线性关系类似于 Sigma cat. # B2787 的参考产品。

ScanLater Western Blot 检测方法
ScanLater Western Blot 工作流程遵循标准的凝胶上样和印迹方法，直到二抗孵育步骤。与感兴趣的蛋白样品一起，简单地将其中一条泳道加载到带有 4 µL ScanLater Western Blot protein Ladder 的凝胶上。ladder 不需要加热或其他准备。用一抗孵育后，膜进行封闭和洗涤，然后用 1:5000 铕 - 链霉亲和素和 1:5000 铕 - 二抗孵育，铕 - 链霉亲和素与蛋白 ladder 结合，且铕 - 二抗特异性地与一抗结合的感兴趣蛋白结合。使用 ScanLater Western Blot 检测卡盒在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3 多功能微孔板读板机上扫描膜，该检测卡盒利用时间分辨荧光 (TRF) 检测铕 (Eu)。
TRF 检测显著降低了来自自发荧光或其他短寿命发射光的背景噪声。没有化学发光或标准荧光检测常见的相机光晕 ; 因此，该系统提供高信噪比的锐利条带。 该方法不涉及酶反应，因此消除了蛋白质定量固有的可变性。 铕是抗光漂白的，所以western blot 信号在几周到几个月的时间内保持稳定，这使得膜的重复读取成为可能。ScanLater Western Blot 检测系统，包括 ScanLater Western Blot Protein Ladder，是一个简单、灵敏、稳定的平台，在多功能酶标仪中提供卓越的蛋白分析能力。
已知蛋白质的可视化估计
白细胞介素 -17 和热休克蛋白的进一步实验也证明了使用ScanLater Western Blot Protein Ladder 来估计分子量。
白细胞介素 -17
将白介素 -17 (IL-17) 上样到 4-20% 梯度凝胶中，1X 运行缓冲液中，运行 30 分钟。在同一凝胶上也上样了 ScanLater Western Blot Protein Ladder。
将蛋白转移到 Immobilon-FL 膜上，用大鼠抗 -IL-17 作为探针过夜，然 后用 1:5000 ScanLater 铕 - 抗 - 大鼠 IgG 和 1:5000ScanLater 铕 - 抗 - 链霉亲和素抗体孵育 1 小时。如图 3a 所示，用带有 ScanLater Western blot 检测卡盒的 SpectraMax i3 多功能微孔板读板机对洗涤和干燥好的印记进行扫描。使用ScanLater Western Blot Protein Ladder 估计 IL-17 的分子量约为 14 kD，而公布的分子量范围约为 15 kD。

图 3 (3a) IL-17 的分子量估算。使用 ScanLater Western Blot Protein Ladder 估算 IL-17 的分子量。(3b) Western blot 显示 HSP70 的升高。Western blot 显示，当细胞暴露在高于正常温度的环境中时，HSP70 蛋白含量会增加。估计其分子量约为 70 kD。

热休克蛋白
热休克蛋白 (HSP70) 是在高于正常培养温度的细胞中诱导产生的。在本研究中，CHO-K1 细胞和 HeLa 细胞暴露于45℃ 45-90 分钟后 6 小时采集细胞提取物。每个细胞样品提取液 5µL，凝胶梯度4-20%。4 µL 的 ScanLater Western Blot Protein Ladder 也被上样到凝胶上。转移后，封闭印记，洗涤并用小鼠抗 -HSP70 标记过夜，然后用铕 - 抗 - 小鼠 IgG 孵育 1 小时。本实验将 ladder 与抗铕 - 链霉亲和素单独孵育。在图 3b 所示的反向图像中，由于染色淬灭了TRF 信号，预染色标准品呈现出苍白的条带。两种细胞系的 HSP70 均随温度升高而升高。通过与 ScanLater Western Blot Protein Ladder 的比 较，估计 HSP70 蛋白的大小约为 70 kD。
总结
ScanLater Western Blot Protein Ladder 可以估计蛋白质的大小，如图 1 中的亮条带所示，同时在电泳过程中以及转移过程中和之后的凝胶上提供可见的指标。 使用该系统，用户可以遵循电泳和印迹工作流程，这是为他们的应用优化。与铕 - 链霉亲和素和铕 - 二抗 混合孵育，可以在 TRF 模式下用
SpectraMax i3 或 Paradigm 多功能微孔板读板机对 ladder和感兴趣的蛋白进行低本底检测。图像可在 SoftMax Pro 软件中生成，包括集成的可导出到一个自定义宏的 Excel 中以进行定量分析。 随着 ScanLater Western Blot Protein Ladder 的加入，ScanLater Western Blot 检测系统在多功能酶标仪中提供了卓越的灵敏度和蛋白分析能力。