如何利用 SpectraMax Plus 384 微孔板读板机对葡萄酒中残糖含量进行检测

介绍
在葡萄酒生产过程中，检测苹果酸、残留糖、挥发酸和氨的水平是质量控制非常重要的指标。酶检测采用微孔板进行，可定量并提高通量，从而节省时间和人力。残留糖测定涉及到分析物的酶转化并产生副产物 NADPH。测定 NADPH的 量，通过340 nm下光吸收检测，可以直接定量葡萄酒中待测物。下面我们介绍如何使用Molecular Devices 的 SpectraMax Plus384 微孔板读板机和 SoftMax Pro 软件高效收集和分析酶检测葡萄酒中残留糖的方法。SpectraMax Plus 384 微孔板读板机优势：
• 波长范围：190-1000 nm，1 nm 步进，无需加购滤光片，波长涵盖 UV
• 读板速度：96 孔板：5 s；384 孔板，16 s
• 温控：室温 +4 ℃ ~ 45 ℃
• 比色皿功能：可用标准比色皿，12 × 75mm 比色皿
• OD检测范围：0-4 OD

葡萄酒中残留糖 (RS) 的酶检测酶反应：
优势
• 与传统的比色皿方法相比，提高了通量
• 使用 SoftMax Pro 软件进行自动数据分析
• PathCheck 传感器用于微孔板孔中的吸光度读数的标准化
HK：己糖激酶
PGI：磷酸葡萄糖异构酶
G6P-DH：6-磷酸葡萄糖脱氢酶
反应动力学
本实验主要检测葡萄酒中两种主要的糖，葡萄糖和果糖。自从 NADPH 能够用与其相关的 6-磷酸葡萄糖计量，我们就可以通过检测 340 nm 下葡萄糖 + 果糖的量来代表 NADPH。
PathCheck 功能
PathCheck 是 Molecualr Devices 公司特有技术，用来检测微孔板中样品的光程。该创新方法可将微孔板检测的光吸收值转化成 1 cm 标准比色皿的。朗伯-比尔定律
A = E*C*L
E = 吸收率 ( 消光系数 )
C = 浓度

图 1 SpectraMax Plus 384 光学构造(1)Glucose + ATP (HK) Glucose-6-Phosphate + ADP(2)Fructose + ATP (HK) Fructose-6-Phosphate + ADP(3)Fructose-6-phosphate (PGI)Glucose-6-Phosphate(4)Glucose-6-phosphate + NADP(G6P-DH)Glucose acid-6-phosphate+ NADPH + H+

L = 光程
如果使用比色皿，光程是水平的，因此固定是 1 cm。但是如果使用微孔板，光程是垂直的。所以，光程取决于样本体积，见图 2。
SoftMax Pro 软件
该软件控制仪器，采集数据并提供完整的数据分析。特定仪器设置和计算公式能预先保存成客户自定义的方法。操作员可以直接打开预设方法，读板后即可得到完整的计算分析结果。
材料
• SpectraMax Plus 384 微孔板读板机(Molecular Devices cat. #PLUS 384)
• 紫外透 96 孔板 (Corning cat. #3635)
• 移液器( Drummond Scientific cat. #2704174,2705402, 2705412, 2704180; Drummond 数字微量分液器 cat. #3-000-510 )
• 移液器吸头(Eppendorf cat. # epT.I.P.S. Reloads022491539, 022491512, 022491547)
• 离心机 (Eppendorf cat. #5424)
• 1.5 mL 离心管(Eppendorf cat. #022364111, 022363557,022363514, 2236357-3)
• D-果糖 (Fisher Scientific cat. #L95-500)
• 己糖激酶/6-磷酸葡萄糖脱氢酶 30 mg(10 mL, Roche cat. #10737275001)
• 磷酸葡萄糖异构酶 10 mg/mL(Roche cat. #10128139001)
• 聚烯吡酮(Fisher Scientific cat. #BP431-100)
• TRIS (Amresco cat. #0497-500G)
• MgSO4•7H2O(Fisher Scientific cat. #M63-500)
• ATP (Boehringer Mannheim cat.#10519987001)
• NADP (Boerhringer Mannheim cat.#10240354001)
• 1.0M HCl(Fisher Scientific cat. #SA431-500)

果糖标准品的制备
混匀试剂，直至完全溶解。标准品存储在1.5 m 冻存管中，-4 ℃ 保存，做出的标准曲线确定系数 R = 1.000。如果试剂放置太久，可能导致无法做出理想的标准曲线。
RS缓冲液的制备
聚烯吡酮 (PVP) 2.0 g，TRIS 3.0 g 和MgSO4•7H2O 0.5 g 加入至 350 mL 去离子水中，用 1.0 M HCl (≈36 mL) 调节 PH 至7.6。然后，加入 0.15 g ATP 和 0.175 gNADP，容量瓶定容至 500 mL。配置好的缓冲液存储于 4 ℃。
RS 分析中葡萄酒样品的制备
如果需要，葡萄酒样品按照表 2 用去离子水稀释。浑浊样品在稀释前或稀释后离心或过滤后待用。
样品用去离子水 1：10 稀释，相当于标准稀释 1：10 至 4.0 g / 100 mL。样品用去离子水 1：100 稀释，相当于标准稀释 1：100 至 10.0 g / 100 mL。
方法
第一步：空白对照，标准品和样品做重复

第二步：从冰箱中取出 D-果糖，室温融化
第三步：取出分析所需体积的标准品和样品缓冲液至室温，烧杯上标记“RS”。这步对获得理想的确定系数非常关键。
第四步：磷酸葡萄糖异构酶 (PGI) 按照表 3加入缓冲液中。PGI 需要与缓冲液完全混合，但必须轻柔以防酶变性。
第五步：用排枪将 300 µL 缓冲液加入至每孔。
第六步：在相应孔中加入 5 µL 去离子水，标准品或样品。
第七步：枪头上下混匀试剂。
第八步：微孔板振荡混匀 30 s；然后用微孔板读板机进行初次光吸收读板

第九步：初次读板后，立刻用 1-20 µL 排枪往每孔加入 5 µL HK / G6P-DH。
第十步：微孔板振荡混匀 30 s，室温孵育21 分钟。
第十一步：21 分钟孵育结束后，在微孔板读板机上采用同样的参数设置进行最终读板。
仪器参数设置
仪器通过 SoftMax Pro 软件控制。参数设置按照图 4 在软件上完成。表 4 显示的是RS 分析的仪器参数设置。图 4 是波长设置和“PathCheck”选项设置的截屏。创建 2 个相同的参数设置。初始板部分包括除了酶以外的所有试剂。第二块板部分是加入酶后的实际反应结果。通过 reduction 的设置，用加酶后光密度值减去初始值。
RS分析孔板定义
软件中的孔板定义是为了在微孔板中标记标准品和样品的对应孔位置。灵活的孔板定义方式，能够轻松设置多个样品和重复。初始板中，无需孔板定义。最终板中，定义标准品和未知样品的位置。标准品的浓度通过点击该孔进行设置，输入相应浓度。浓度范围是 0-0.4 g / 100 mL ( 图5 )。
Reduction设置
最终板是酶实际反应后的结果。Reduction 设置 ( 图 6 )，用最终板的光密度值减去初始板的。因此无需使用板空白。板空白已合并入实验的质量控制中。

结果
实验操作见材料和方法中的描述。孔板中包括除酶以外的所有试剂读板的结果作为基线 ( 图 7，A )。加入酶后混匀，并室温放置 21 分钟后读出最终读数 ( 图 7，B )。SoftMax Pro 软件自动计算并在相应分组中显示出标准品的平均值，标准偏差和 %CV ( 图 8 )。
标准曲线
标准曲线通过“STD”分组的结果绘制出， x 轴是浓度，y 轴是 OD 值的平均值( 图 9 )。标准偏差作为误差线，用线性方程拟合。标准曲线用来计算葡萄酒样品中标记为“Unknown”组样品的残留糖浓度。
模板中指定为“未知”的样本数据自动填充为“未知”组部分。每个样品的残留糖都是通过软件中标准曲线的截距计算出来的 ( 图 10 和 11 )。

结论
SpectraMax Plus 384 微孔板读板机是通过酶定量分析葡萄酒中残留糖 (RS) 和苹果酸 (ML) 的最佳选择，同样也能应用在其他相似分析上，如氨和挥发酸的检测。
优势如下：
• 经济且省时
• SpectraMax Plus 384 具有波长灵活和PathCheck 功能，能帮助实验获得更精
确和准确的结果
• SoftMax Pro 软件在分析和计算复杂且数据多的结果时非常方便。它能够预设模板，即开即用的方法，用户自定义公
式和多样的图表选择
• 其他 Molecular Devices 具有光吸收检测功能的微孔板读板机，如：SpectraMaxi3x 多功能微孔板读板机，也能进行该应用分析
• 针对高通量需求，Molecualr DevicesStakMax 微孔板堆板机系统能够整合SpectraMax 微孔板读板机，进行 20、
40 和 50 块板的自动进样。