利用 NanoBRET 技术检测 p53-MDM2 蛋白相互作用

简介
BRET ( 生物发光共振能量转移 ) 是一种测量蛋白 - 蛋白或蛋白 - 配体相互作用的技术，涉及生物发光供体和荧光受体的相互作用。当供体和受体彼此相距小于 10 nm时，供体激发受体，然后受体发射荧光。通过用供体标记一种目的蛋白，用受体标记该目的蛋白的结合配体，可以使用酶标仪来检测供体和受体发射的光，从而测量蛋白质相互作用。
Promega 的 NanoBRET™ 技术通过使用更亮的发光供体 ( NanoLuc 荧光素酶 )、优化的能量受体 (HaloTag®-NCT) 以及供体和受体波长之间更宽的分离，改进了早期的BRET，包括 BRET1 和 BRET2 ( 见图一 ) 不足。这些改进提供了更强的信号，更好的灵敏度和更低的背景，使得在活细胞内检测蛋白质相互作用成为可能。检测 NanoBRET 信号并分析结果数据需要灵敏的仪器和功能强大的分析软件。标配SoftMax Pro 软件的 SpectraMax iD5 多功能酶标仪可让研究人员使用优化的滤光片组系统获得 NanoBRET 数据结果，并对结果进行包括曲线拟合在内的分析。在这里，我们描述了在 SpectraMax iD5 酶标仪上使用 NanoBRET™ PPI 质控对来验证酶标仪功能，该质控对由相互作用的蛋白质配偶体 p53 和 MDM2 组成。使用 p53 途径激活剂 nutlin-3 以浓度依赖性方式破坏p53 与 MDM2 的相互作用，并使用 SoftMax
Pro 软件分析和绘制结果。
优势
• NanoLuc 带来更强的光学信号、更宽的光谱，较其它 BRET 技术具有更高灵敏度
• 正常生理的活细胞下能够更灵敏的检测蛋白相互作用
• 使用 SoftMax Pro 软件自动计算 NanoBRET 比率并拟合生成曲线

材料
• NanoBRET PPI 质控对(p53, MDM2; Promega cat. #N1641)
• NanoBRET Nano-Glo® 检测体系(Promega cat. #N1661)
• ViaFect™ 转染试剂(Promega cat. #E4981)
• Nutlin-3 (Millipore-Sigma cat. #6287)
• Opti-MEM™ 36/5000 减少量的血清培养基 ， 无 酚 红 ( T h e r m o F i s h e r c a t .#11058021)
• 293 (HEK-293) 细胞(ATCC cat. #CRL-1573)
• Eagle's Z低限度基础培养基(EMEM, Corning cat. #10-010-CV)
• BenchMark™ 胎牛血清(Gemini Bio-Products cat. #100-106)
• 青霉素-链霉素(10,000 U/mL, ThermoFisher cat.#15140122)
• 6 孔透明微孔板 (VWR cat. #1006-892)
• 96 孔白色平底聚苯乙烯微孔板 (Corningcat. #3917)
• SpectraMax iD5 多功能酶标仪(Molecular Devices cat. #iD5-STD), 包括以下配置:
• 供体滤光片: 447 nm BW 60 nm (Molecular Devices cat. #6590-0088)
• 受体滤光片: 610 nm LP (MolecularDevices cat. #6590-0117)
方法
将 HEK-293 细胞以 400,000 个细胞/mL 悬浮于细胞培养基 ( EMEM + 10％ 胎牛血清 +1％ 青霉素/链霉素 ) 中，并接种到 6 孔板上，每孔 2 mL，或每孔 800,000 个细胞。使细胞在 37℃，5％ CO2 下与孔接触 4-6小时。然后用 100 μL Opti-MEM 减少量的血清培养基，无酚红，含 2 μg p53-HaloTag融合载体 DNA 和 0.2 μg NanoLuc-MDM2融合载体 DNA，和 3：1 ViaFect 转染试剂：DNA 比例，来转染细胞。细胞在 37℃，5％ CO2 下孵育过夜 20-24 小时。

通过以 1,000 rpm 旋转 5 分钟收获HEK-293 细胞，弃去培养基。在 Opti-MEM+ 4％ FBS 中将细胞密度调节至2.2×105个细胞/ mL，并分装在两个 15 mL 锥形管。一管用 0.1 μM HaloTag 618 配体处理，另一管无配体处理。将细胞以每孔2×104 个细胞接种到 96 孔白色微孔板中，并立即用 1：3 连续稀释的 nutlin-3 ( 每个浓度 n = 4 个重复 ) 或 0.5％ DMSO 处理。将细胞在 37℃，5％ CO2 下孵育过夜。
在 Opti-MEM + 4％ FBS 中制备 5x NanoBRET Nano-Glo 底物溶液，并向每个孔中加入 25 μL。使用表 1 中所示的设置在SpectraMax iD5 酶标仪上测量供体发射光(447 nm) 和受体发射光 (610 nm)。通过将受体信号除以供体信号在 SoftMax Pro软件中计算 NanoBRET 比率，并将比率乘以 1000 以获得整数 milliBRET 单位(mBU)。通过减去不含配体的样品的平均mBU 来对 mBU 值进行背景校正。 分析了n u t l i n - 3 处理的细胞的结果 ， 并使用SoftMax Pro 软件 ( 版本 7.0.3 和更高版本 )中的 4 参数曲线拟合图表。在每种浓度的 nutlin-3 下计算 Z' 因子以评估测定性能。

结果
使用 SoftMax Pro 软件中的 4 参数曲线拟合，绘制 NanoBRET 比率 (mBU) 对nutlin-3 浓度的曲线 ( 图 2 )。计算出的
nutlin-3 的 IC50 值为 1.2 μM，与 Promega对 NanoBRET PPI 质控对所示的结果一致。
在用于产生图 2 所示曲线的所有浓度的nutlin-3 下获得至少 0.7 μM 的 Z' 因子。对于 0.07 μM 和更低的浓度，Z' 因子等于0.9 μM。 这些值证明了这种 NanoBRET 分析的稳定性和低变异性。
总结
SpectraMax iD5 酶标仪配备了用于检测NanoBRET 供体和受体信号的极佳滤光片，被证明了可以使用 NanoBRET PPI 对质控对 (p53，MDM2) 进行测定。Nutlin-3用于以浓度依赖性方式破坏 p53-MDM2 相互作用，产生 1.2 μM 的预期 IC50 值。对于所有测试样品浓度，计算以评估测定性能和重复变异性的 Z' 因子在 0.7 和 1 之间，证实了 SpectraMax iD5 酶标仪的灵敏度和 NanoBRET 实验的稳定性质。SoftMax Pro 软件可计算 NanoBRET 比率并自动绘制数据，简化分析。