鱼肉中孔雀石绿检测的固相萃取方法（Copure® ALA/PRS）

一、样品提取 

准确称取鱼肉样品 5.0 g 于 50 mL 离心管 1 中，加入 1.5 mL  20% 的盐酸羟胺，2.5 mL 1.0 mol/L 的对甲苯磺酸，5.0 mL 乙 酸钠 - 对甲苯磺酸缓冲液（4.95 g 无水乙酸钠及 0.95 g 对甲 苯磺酸，用乙酸调 pH=4.5，定容至 1 L），匀浆机均质 30 s（10000  r/min）。加入 10 mL 乙腈，剧烈振摇 30 s。加入 5 g 酸性氧 化铝，震荡 30 s。离心机离心 10 min（3000 r/min）, 取上清 液转移至预先加好 10 mL 水、2 mL 二甘醇的离心管 2 中。加 入 10 mL 乙腈至离心管 1 中，重复上述提取一次，合并乙腈层。 离心管 2中加入 15 mL二氯甲烷，振荡 10 s，离心 10 min（3000  r/min），取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用 5 mL 乙腈、10  mL 二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。 将提取液 45℃旋转蒸发至 1 mL，再用 2.5 mL乙腈溶解，待净化。 

二、SPE 柱净化（Copure® ALA，1000 mg/3 mL；Copure®  PRS，500 mg/3 mL） 

活化：按照 ALA 柱在上，PRS 柱在下顺序将两柱串联，固相萃取柱使用前使用 5 mL 乙腈活化。 

上样和洗脱：将梨形瓶中的待净化液转移至 ALA 柱中净化， 梨形瓶使用 5 mL 的乙腈分两次洗，弃去 ALA 柱，吹 PRS 柱 至近干，在不抽真空的情况下，加入 5 mL　5% 氨水乙腈溶 液进行洗脱，收集洗脱液。 

重新溶解：洗脱液 45℃氮吹至近干，用 1 mL 乙腈定容， 过 0.45 µm 滤膜，待上机测试。 

三、仪器条件 

设备：Waters Alliance 2695 色谱柱：XB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 µm) 检测器：Waters 2487 紫外检测器 检测波长：618 nm 流动相：A：乙腈   B：0.05 mol/L 乙酸铵缓冲溶液 洗脱方式：梯度洗脱 见表 1 

表 1 梯度洗脱条件