牛奶中活性蛋白的分析

乳及乳制品已是我们补充优质蛋白的重要来源，也是饮食中不可或缺的部分。选择乳制品时，蛋白质的含量是关键指标。乳制品中主要含有哪些活性乳蛋白？如何分析这些乳蛋白？本文分享了一种有效测定牛奶中乳白、乳球和乳铁蛋白的分析方法，可为液态奶的工艺优化提供数据支撑。

文/王象欣

牛奶蛋白质总量中大约20%^[1]是乳清蛋白。乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（β-Lg，占乳清蛋白50%）、α-乳白蛋白（α-Lac，占乳清蛋白25%）^[2]，其中β-Lg包含β-Lg A和β-Lg B两种遗传变异体。常乳中乳铁蛋白(Lf)的含量受奶牛品种和季节性的影响很大。^{[3] [4]}

乳铁蛋白(Lf)是一种能够与铁结合的糖蛋白，可以促进肠道对铁元素的吸收，提高机体铁含量^[11]；Lf还被称作免疫因子，具有抗.菌^[12]、抗病毒^[13]、抗氧化^[14]和调节机体免疫力^[15]等作用。GB 14880-2012《食品营养强化剂使用标准》将乳铁蛋白列为了新型营养强化剂，并规定了其在相关乳制品中的含量标准。

本研究采用超gao效液相色谱法（UPLC），测定牛奶样品中乳铁蛋白(Lf)，α-乳白蛋白(α-Lac)和β-乳球蛋白(β-Lg)的含量。α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)和乳铁蛋白(Lf)的检测方法参照GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》对方法进行了确认，满足标准各项要求。

一、材料与方法

1试剂与耗材

本实验所用试剂乙腈（CH₃CN）和三氟乙酸（CF₃COOH）为色谱纯级别；

氯化钠（NaCl），磷酸二氢钠（NaH₂PO₄），磷酸氢二钠（Na₂HPO₄），冰醋酸为分析纯；

所用水由Milli-Q超纯水仪（默克公司）提供的符合GB/T 6682规定的一级水。

肝素亲和柱（4℃冰箱内储存），规格为1.5mg，3mL；0.22μm聚醚砜水相滤膜。

2仪器与设备

超gao效液相色谱仪，配有紫外检测器；十万分之一分析天平；高速冷冻离心机；Milli-Q超纯水仪；涡旋振荡器。

3 标准物质

本实验所用标准物质为CRM级别，均来自于默克Supelco^®品牌 Cerilliant^®，其中乳铁蛋白(Lf)的标准品编号为 L-047；α-乳白蛋白(α-Lac)的标准品编号为L-045；β-乳球蛋白(β-Lg)的标准品编号为L-046。

4 分析方法

4.1 乳铁蛋白的测定

· 称取10g（精确至0.01 g）牛奶样品于100mL三角瓶中，先加入30mL结合缓冲液（84mmol/L Na₂HPO₄，16 mmol/L NaH₂PO₄），涡旋振荡混匀1min，将样品全部转移至容量瓶，再加入结合缓冲液定容至50mL后混匀；

· 将样本转移至离心管于4℃条件下以12000 r/min转速离心10 min，离心后轻轻取出中间层，上层有脂质，下面有沉淀，用大量程的移液器将中间液体部分吸出，注意不要吸取上层脂质和下层沉淀。取其中的10mL作为样品提取液。

·  肝素亲和柱先加入5 mL结合缓冲溶液（84mmol/L Na₂HPO₄，16 mmol/L NaH₂PO₄）平衡，处理完毕后加入样品提取液，待样液完全流出后，再用10 mL淋洗液（42mmol/L Na₂HPO₄，8 mmol/L NaH₂PO₄，100 mmol/L NaCl）淋洗，弃去全部流出液。

· zui后用2.5 mL洗脱液（42mmol/L Na₂HPO₄，8 mmol/L NaH₂PO₄，1mol/L NaCl）洗脱，收集全部流出液，定容至3.5 mL。将收集溶液过滤膜，供液相色谱检测分析用。通过C4色谱柱（100 mm×2.1mm，1.7μm，300Å）进行分离。

· 梯度洗脱，流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度条件见表1所示，流速为0.3mL/min，柱温为45 ℃，进样量为10μL；通过紫外检测器280 nm下进行检测，样品色谱图见图1所示。

表1：乳铁蛋白梯度洗脱条件

图1 牛奶样品中Lf的色谱图

4.2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定

· 取5 g（精确至0.01 g）牛奶样品至50mL离心管中，加入15.0mL水混匀，加入冰醋酸（约30μL）调节pH为4.6±0.1左右，涡旋震荡1min，室温静置至少20min后，在10000转，4℃条件下离心10min。

· 取1mL上清液稀释10倍后，过0.22μm滤膜，上机检测。通过C4色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm,300Å）进行分离。梯度洗脱，流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈；

· 梯度条件见表2所示，流速为0.3mL/min ，柱温为45 ℃，进样量为10μL；通过紫外检测器280 nm下进行检测，样品色谱图见图2所示。

表2：α-乳白蛋白和β-乳球蛋白梯度洗脱条件

图2 牛奶样品中α-Lac和β-Lg 的色谱图

二、实际样品的测定数据

牛奶样品来自11个省份、自治区、直辖市的大型超市，并结合网络，抽取试验所用样品。其中20种保质期为常温12个月的纯牛奶，20种保质期为常温6个月的纯牛奶，10种ESL牛奶，15种巴氏杀菌牛奶，每种10个批次。对上述样品按照2.4所述方法进行分析，结果如表3所示。

表3：市售样品中未变性α-Lac、β-Lg、Lf的含量

三、结论

经方法学验证，3种活性蛋白其线性范围内线性关系良好，方法回收率、精密度符合GB/T 27404-2008中的相关要求，该方法快速、灵敏、准确，适合牛奶样品的检测，也可为液态奶的工艺优化提供数据支撑。

参考文献：

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https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/milk-protein-crm.html

“默克分析化学”公众号为您提供全面的分析化学行业应用和解决方案。本月起，我们将定期邀请行业专家，分享前沿技术解读、行业应用和热门科研分析。本期我们邀请到的是王象欣老师，原就职于国家乳制品质量监督检验中.心，现就职于黑龙江飞鹤乳业有限公司，从事研发工作，曾参与过婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定标准制定工作，食品安全国家标准食品中肌醇的测定标准制定工作，从事多年婴幼儿配方乳粉检测工作，了解婴幼儿配方乳粉的组成、工艺，熟悉ICP-MS、ICP-OES、HPLC-MS、GC-MS、AFS、AA等大型仪器，熟悉实验室方法开发、方法优化，方法不确定度评估等工作。