质粒电泳方法步骤

质粒是生物体内细胞质中染色体（或拟核）以外的DNA分子。做质粒电泳需要先提取质粒DNA，质粒dna的抽提是基因工程工作中的一项基本实验技术,质粒提取方法有很多种,以下介绍一种Z常用的方法。

质粒DNA提取方法

一、碱裂解法:

此方法适用于小量质粒dna的提取,提取的质粒dna可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析。方法如下:

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mllb培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。

4、加0.lml溶液i(1%葡萄糖,50mm/ledtaph8.0,25mm/ltris-hclph8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液ii(0.2mm/lnaoh,1%sds),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min。

6、加入0.15m1预冷溶液iii(5mol/lkac,ph4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min。

7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新ep管

8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。

10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlte缓冲液中

二、煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120mlstet溶液中,涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。质粒dna的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒dna,为此需要大量提取质粒dna。大量提取的质粒dna一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

质粒电泳

一、质粒的三种形态：

1、超螺旋结构：两个螺旋交联，在DNA的螺旋葙础上，扭曲成f 一个超螺旋结构

2、开环结构：双链的有一条链断开，超螺旋DNA的螺旋变得松弛，变成/环形质粒

3、线性结构：双链的质粒DNA都断开，形成的单链，但足这种造型的比较少

质粒在电泳过程中由于展开的性状不同,会形成3个条带，开环由于展开向积Z人，阻力比较大，会出现在Z后，线性的会在中间，而超螺旋结构由于紧缩的很小，所以会跑在Z前向'。

二、琼脂糖凝胶质粒电泳装置

质粒电泳是一种琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物,应选用电泳纯的,琼脂糖此级产品筛除了YZ物和核酸酶,而且用溴化乙锭染色后荧光背景Z小。

(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高,而适应性又强,在过去20年里已成功地设计了形形色se及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用Z普遍的装置是walterschaffner发明的水平板凝胶。水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中,则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同,所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。

(2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中,令其固化。凝固后,琼脂糖形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后,在中性ph值下带负电荷的dna向阳极迁移。

(3)琼脂糖凝胶的染色电泳完毕,将琼脂糖凝胶转移入含eb的染液中,染色10分钟,取出紫外灯下观察。

关于质粒大小在电泳中的鉴定 用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度Z慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在Z后。

判断质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。 因为用质粒转染真核细胞时， 超螺旋的质粒效率Z高， 所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在 90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。 

Z后，前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖，取出样品，在紫外灯下观察，摄像。

三、琼脂糖质粒电泳步骤

1、称取适量的琼脂糖，放入三角瓶中，加入一定量的0.5*TBE，在微波炉上加热，是琼脂糖熔化。

2、等凝胶温度降至55摄氏度一下时，加入2-3微升的0.5mg/ml的溴化乙锭，再将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将熔化的琼脂糖倒入放有移胶板的胶室中。

3、等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状，将梳子轻轻地垂直拔出，用拇指和指示轻持移胶板两侧，将凝胶体放入加有0.5*TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液浸没胶面，高出胶面。

4、取1-2微升上样缓冲液滴在封口膜上，与一定量DNA样品混合均匀后，一同加入到凝胶孔中，样品应沉淀于孔底，此外要加入适合的DNA标准 样品。

5、盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压，以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA样品从负极向正极移动。

6、前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖，取出样品，在紫外灯下观察，摄像。